经右侧颈总动脉插管脑灌注对深低温停循环兔脑组织超微结构与自由基的影响

　　作者：韩家付　　作者单位：江苏大学附属人民医院 心胸外科，江苏 镇江 212000

　　【摘要】 目的 观察深低温停循环(DHCA)时经右侧颈总动脉插管脑灌注对兔脑组织超微结构与自由基的影响。方法 健康大耳白兔16只,随机分为2组,每组8只。实验组给予DHCA 60min +经右侧颈总动脉插管脑灌注处理;对照组仅作DHCA 60 min处理。两组分别于停循环后60min恢复循环，至鼻咽温度和肛温均30℃时维持30min,停机，处死动物，取少量脑组织检测超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)含量并进行比较，同时取脑皮质通过透射电镜观察脑组织超微结构的改变。结果 实验组脑组织MDA含量明显低于对照组(P<0.01)，SOD活性明显高于对照组(P<0.01)。电镜结果显示，实验组各种神经元细胞器损伤较对照组明显减轻。结论 DHCA期间应用右侧颈总动脉插管脑灌注符合生理情况，可维持DHCA时脑血流的供应，清除自由基，减轻脑损伤。

　　【关键词】 深低温停循环 丙二醛 超氧化物歧化酶 脑灌注 兔

　　深低温停循环(DHCA)技术广泛应用于复杂先天性心脏病、主动脉弓及胸主动脉手术中，但是,中枢神经系统对缺血的耐受力低限制了停循环的安全时限,停循环超过45～60min后神经系统并发症发生率显著上升[1]。由于深低温条件下脑代谢活动并非完全停止，使脑缺血缺氧逐渐加重;而DHCA后的再灌注又会加重脑组织的病变，形成脑缺血再灌注损伤。目前对DHCA导致的脑损伤机制仍不十分清楚。近年来,临床上采用选择性顺行性脑灌注在DHCA中进行脑保护,取得较好效果[23]。我们利用兔DHCA模型,观察经右侧颈总动脉插管灌注对DHCA兔脑组织的超微结构和自由基的影响,探讨其可能的脑保护机制,为该技术在临床应用提供实验依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　成年健康大耳白兔16只,雌雄不拘,体重2.2～2.9kg(江苏大学动物养殖中心提供)。动物饲养与实验要求均符合我国卫生部《医学实验动物管理实施细则》(1998)的规定。将动物随机分为2组,每组8只。实验组给予DHCA 60 min +经右侧颈总动脉插管脑灌注处理;对照组仅作DHCA 60 min处理。

　　1.2 主要仪器与试剂

　　Stockert双头滚压泵，BP200婴儿呼吸机，多导生理监护仪，动物实验膜肺(西安西京医疗用品有限公司提供)，超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

　　1.3 体外循环准备

　　预充新鲜兔全血50ml,血定安20 ～ 30ml,5%碳酸氢钠5ml,10% MgSO4 0.3ml•kg-1,甲基氢化泼尼松15mg•kg-1,总预充量为75～85ml。16G套管针主动脉插管,右心房插管内径4mm,右心房重力引流落差40～60cm。

　　1.4 体外循环动物模型的建立

　　动物术前12h禁食,不禁水。清醒状态下称重,建立耳缘静脉通路。25%乌拉坦静脉麻醉，麻醉后气管切开，插管,接呼吸机,维持PO2在100～300mmHg(1mmHg=0.133kPa),PCO2在35～45mmHg。右股动脉插管检测平均动脉压(MAP)。耳静脉注入肝素400U•kg-1,术中根据活化凝血时间(ACT)适当补充。胸骨正中切口暴露心脏,对照组升主动脉插灌注管,实验组分离右侧颈总动脉行动脉插管。两组均经右心耳插房管,建立体外循环(CPB)，并行降温使鼻咽温度降至30℃,心包腔置冰屑局部降温,继续降温至鼻咽温度为18℃时停循环。实验组停循环后阻断无名动脉、左锁骨下动脉和左颈总动脉,经右侧颈总动脉插管脑灌注,流量为10ml•min-1•kg-1;两组动物均停循环60min之后恢复循环,同时加入10% MgSO4 0.3ml•kg-1、甲基氢化泼尼松15mg•kg-1、甘露醇1.5g、速尿2mg,10min后缓慢复温,复温时间超过1h，直至鼻咽温和肛温均36℃时维持30min,停机。处死动物，在最短时间内完整取出兔脑,切取左侧脑组织,放入液氮中保存,统一测定。

　　1.5 脑组织SOD活性及MDA含量测定

　　取出的大脑皮层组织称重,冰浴中匀浆,4℃下2 000r•min-1离心10min,取上清液,采用黄嘌呤氧化酶法检测脑组织SOD活性,硫代巴比妥酸法测定脑组织MDA含量。

　　1.6 透射电镜观察

　　取大脑皮层组织约1mm3,放入4%戊二醛前固定,1%锇酸后固定,乙醇梯度脱水,环氧树脂包埋,制成超微薄片,醋酸钠柠檬酸铅双重染色,于透射电镜下观察神经元超微结构。

　　1.7 统计学处理

　　采用SPSS10.0统计软件包进行分析,实验数据用x-±s表示,两组之间均数比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 形态学观察

　　每组随机观察3例标本。透射电镜观察显示：对照组神经细胞核周围出现水肿,核周间隙增宽,核内染色质溶解和边缘化，胞质内空泡化，细胞器密度减少;线粒体肿胀和空泡化,嵴稀疏并溶解消失;内质网增宽、断裂;毛细血管周围间隙增宽，内皮细胞肿胀出现溶解性空泡，线粒体空泡化,内质网断裂,核染色质溶解、边聚化。实验组神经细胞各种器损伤较对照组明显减轻,细胞膜和核膜改变相似(图1A～C)。

　　A.对照组深低温停循环60min后的神经细胞结构 醋酸钠柠檬酸铅染色×15 k

　　B.实验组深低温停循环60min+顺行脑灌注的神经细胞结构 醋酸钠柠檬酸铅染色×15 k C.正常大耳白兔脑神经细胞结构 醋酸钠柠檬酸铅染色×20 k

　　图1 兔大脑皮层组织透射电镜图

　　2.2 两组脑组织匀浆中SOD、MDA值的比较

　　见表1。表1 两组脑组织SOD活性及MDA含量比较 由表1可见，实验组脑组织SOD活性明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01);MDA含量明显降低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　3 讨 论

　　自由基毒性学说[45]是学者们探讨较多的DHCA时脑损伤机制之一。近期随着对膜类脂化学的深入研究，发现自由基损伤及自由基所引发的脂质过氧化反应是脑缺血和再灌注损伤的重要因素[6]。与其他组织相比,神经组织具有较高的氧化代谢率、高密度的膜不饱和脂肪酸以及依赖膜完整的神经元突触传导,故特别易受自由基介导的损伤。氧自由基正常情况下生成量非常低,同时,细胞具有抗氧化系统,可灭活和降解自由基,保护自身免受损伤。在缺血、再灌注过程中,氧自由基的生成量大大超过内源性抗氧化系统的清除能力,大量的自由基侵袭生物膜中不饱和脂肪酸链,生成包括MDA在内的各种氧化终产物,使细胞膜、内质网和线粒体等生物膜破坏,产生细胞毒性,导致一系列功能紊乱。深低温条件下可减少脑组织需氧量，降低其代谢速度，以此来减少脑缺血所造成的神经系统损害[7]。但在深低温时，脑代谢活动并非完全停止，随着时间的推移，代谢产物仍会逐渐积聚，使脑缺血缺氧逐渐加重。同时，DHCA后的再灌注又加重了脑组织的病变，形成脑缺血再灌注损伤。因此，单纯深低温安全时限有限，不能保护大脑耐受较长时间的缺血、缺氧。

　　在DHCA期间给予脑灌注是延长安全时限的好方法，逆行脑灌注与选择性SCP应用较为广泛，但逆行脑灌注系非生理灌注，存在着灌注压力低、条件不易掌握、易引起脑水肿等缺点。近年来经右锁骨下动脉插管灌注的体外循环技术发展迅速，该方法操作简化，并发症明显减少。Okita等[8]自1997年开始连续给60例行主动脉瓣膜置换手术患者实施了逆行性脑灌注(30例)和选择性顺行脑灌注(30例),结果显示：两组患者医院内死亡均为2例;逆行性脑灌注组新发生脑卒中1例,选择性顺行脑灌注组为2例;逆行性脑灌注组发生暂时性脑功能紊乱者较选择性顺行脑灌注组多;逆行性脑灌注组患者的暂时性脑功能紊乱发生率明显高于选择性顺行脑灌注组。Di Eusanio等[9]对462名体外循环中应用SCP的患者进行了回顾性研究，结果显示，早期神经系统并发症发生率为6.2%，永久性神经系统损伤率为3.8%，停循环时间超过 90min死亡率无明显增加。江朝光等[10]关于DHCA中不同脑保护方法对海马回神经元凋亡影响的实验研究结果显示,SCP可使细胞凋亡和死亡减少,对神经元的保护作用最佳。

　　参照上述临床及实验研究，我们在DHCA情况下采用经右侧颈总动脉插管脑灌注的方法，结果显示,实验组兔脑组织神经元超微结构损伤较对照组明显减轻，脑组织匀浆中SOD活性明显高于对照组，脂质过氧化代谢产物MDA含量明显低于对照组(均P>0.01)。由于MDA是脂质过氧化反应的最终产物,可反映脑组织中自由基的含量和脂质过氧化程度,MDA升高提示自由基生成增多;SOD属于自由基清除酶,对脑缺氧缺血再灌注损伤具有保护作用,SOD活性降低意味着脑组织清除自由基的能力下降。故说明在DHCA中，脑组织缺血缺氧，ATP生成减少,乳酸水平增加,游离脂肪酸增加,使脂质过氧化增加,最终导致MDA增加,SOD活性降低，过量的自由基引起脂质过氧化,产生细胞毒性,损伤细胞;而选择性顺行脑灌注能有效地抑制自由基的释放，同时通过内源性抗氧化物质的增加，增强了清除自由基及脂质抗氧化能力，减轻了自由基对脑组织的损伤，对缺血缺氧脑组织具有保护作用。

　　【参考文献】

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　　[3]孙立忠,刘永民,杨天宇,等.右锁骨下动脉插管体外循环技术的临床应用[J].中华胸心血管外科杂志,2000,16:6870.

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　　[8]Okita Y,Minatoya K,Tagusari O,et al.Prospective comparetive study of brain protection in tolal aoric arch replacemant:deep hyppothermic circulatory arrest with retrogaed cerebral perfusion or selective antegrade celebral perfusion[J].Ann Thorac Surg,2004,72(1):72.

　　[9]Di Eusanio M,Schepens M,Morshuis W,et al.Operations on the thoracic aorta and antegrade selective cerebral perfusion：our experience with 462 patients[J].Ital Heart J,2004,5(3):217222.