血管生成与非小细胞肺癌预后的相关性研究

　　作者：黄礼年,肖伟,陈余清　　作者单位：山东大学，山东 济南 

　　【摘要】 目的 探讨微血管密度 (MVD) 和血管内皮生长因子 (VEGF) 在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及在NSCLC预后中的价值。方法 运用免疫组织化学方法研究43例NSCLC石蜡切片中MVD和 VEGF 的表达。结果 43例NSCLC石蜡标本中，VEGF阳性率为53.5%(23/43)，且与MVD计数具有相关性。MVD计数与NSCLC组织学分化程度、T NM临床分期、淋巴结转移具有明显相关性。单因素生存分析显示MVD、VEGF阳性表达的NSCLC患者术后生存期(OS)缩短(P<0.01);多因素 COX回归分析显示：MVD是NSCLC患者预后的独立预测因子。MVD高表达患者手术后死亡的相对危险度是MVD低表达患者的34.247倍(似然比检验，P<0.01)。结论 VEGF 对NSCLC肿瘤的血管生成可能起重要作用;MVD与NSCLC的转移密切相关，可能是较强的独立预后因子，MVD高的NSCLC患者预后不良。

　　【关键词】 肺肿瘤;微血管密度;血管内皮生长因子

　　Relationship between angiogenesis and prognosis of nonsmall cell lung cancer

　　HUANG LiNian, XIAO Wei, CHEN YuQing.

　　Department of Respiratory, Shandong University, Jinan 250012, Shandong, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the relation between microvessel density (MVD) and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression and the value of MVD and VEGF expression in nonsmall cell lung cancer (NSCLC). Methods MVD and VEGF expression in tumor tissue from 43 cases of NSCLC were examined by immunohistochemistry methods. Results The positive expression of VEGF in 43 patients with NSCLC was 53.5%(23/43)，and it was significantly correlated with MVD count. MVD count had obvious relationship with NSCLC histology differentiation, TNM phage, lymphatic metastasis. The positive expressions of VEGF and MVD predicated shorter overall survival (OS). MVD was an independent prognostic factor of clinical outcome in NSCLC by multivariate analyses. The risk ratio of death was 34.247 fold of patients with MVD high expression compared with MVD lower expression (P<0.01). Conclusions VEGF might play an important role in NSCLC angiogenesis. MVD is closely correlated with NSCLC metastasis and might be an independent prognostic factor, the higher MVD，the worse prognosis.

　　【Key words】 Lung cancer;Microvessel density;Vascular endothelial growth factor

　　肺癌的预后受多种因素的影响，传统的TNM分期不能完全准确地预测肺癌患者的预后，寻找新的判断预后的生物学指标是目前研究的热点之一。研究发现肿瘤的生长、浸润和转移是一个依赖于血管生成的过程，肿瘤新生血管的形成与肿瘤患者的预后密切相关。血管内皮生长因子(VEGF)是目前公认的肿瘤血管生成最重要的刺激因子，在多种实体肿瘤中存在高表达〔1，2〕。但肿瘤血管生成和血管浸润在肺癌的侵袭、转移以及预后中的作用国内外报道不一〔3～7〕。本研究采用免疫组织化学的方法观察非小细胞肺癌(NSCLC)组织中微血管密度(MVD) 和VEGF的表达及其相关性，探讨MVD和VEGF与NSCLC生物学行为的关系及对NSCLC预后的影响。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 43例NSCLC标本取自蚌埠医学院附属医院1996年1月至1999年1月之间的手术标本，术前未行放、化疗。其中男性36例，女性7例;年龄40～76岁，平均(58.9±8.75)岁;鳞癌33例，腺癌10例。依据1981年WHO制定的标准进行肺癌组织学分型，按1997年国际抗癌联盟(UICC)修订的标准进行TNM分类和分期。TNM临床分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期15例，Ⅲ期12例。每位患者自手术日开始计算生存期至5年或至死亡(不满5年者)，时间最短者为3个月，最长为60个月，中位时间27个月，其中1例因搬迁情况不明。

　　1.2 方法

　　1.2.1 主要试剂 VEGF单克隆抗体、CD34单克隆抗体及链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶免疫组化染色试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。

　　1.2.2 免疫组化 每块石蜡标本重新制备4 μm厚切片4张，1张行HE染色，用以核实病理诊断;1张用于VEGF免疫组化染色;1张用于CD34免疫组化染色，1张用PBS代替一抗作阴性对照，用已知乳腺癌阳性切片作阳性对照。免疫组化染色(SP法)按常规操作规程进行。

　　1.2.3 MVD方法及结果判定 参照Weidner等〔8〕报道的方法。MVD 计数时先用低倍物镜(10倍)观察，寻找微血管最多的区域，然后用高倍物镜(200倍)计数3个视野，取其平均值作为MVD。微血管可为单个或一簇棕色的细胞，可有或无管腔。凡血管直径大于8个红细胞或血管壁带有明显肌层以及纤维硬化、炎症及坏死区的微血管均不能计入总数。MVD阈值确定：参照文献报道〔9〕，判断MVD的阈值一般与该组的MVD均值基本一致，≥MVD阈值为“MVD高表达组”或“MVD+”，

　　1.2.4 VEGF结果判定 参考Mattern〔10〕方法，从阳性染色深度(未着色0分，轻度着色1分，中度着色2分，重度着色3分)和每一组织切片中阳性细胞占总细胞数的百分比(0～5% 为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，> 50%为3分) 两个方面判断，两者相加，得分0～2分判定为阴性表达，3～6分判定为阳性表达。

　　1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件包。计量资料以x±s表示，采用t检验、单因素方差分析。计量资料采用χ2 检验。Kaplanmeier法分析生存期并经Logrank检验;COX模型(似然比检验)用于多因素预后分析。

　　2 结 果

　　2.1 NSCLC中MVD分布和VEGF表达情况 43例NSCLC的MVD均值为(31.98±14.93)个/200倍视野，在癌组织内及癌组织周围均可见微血管分布，但以癌组织与正常组织交界处(即癌组织周围的基质) 血管密度最高。VEGF阳性颗粒定位于肿瘤细胞的胞浆内，呈棕黄色，在同一个癌巢中，VEGF 染色阳性细胞分布不均匀，其表达阳性肿瘤细胞主要位于肿瘤浸润区域(图1)。NSCLC中VEGF阳性表达率为53.5% (23/43)。MVD及VEGF表达与NSCLC临床病理关系见表1。

　　2.2 NSCLC中MVD分布和VEGF表达的关系 VEGF阳性表达组MVD值为(42.83±11.915)个/200倍视野，VEGF阴性表达组MVD值为(19.50±5.726)/个200倍视野，组间比较具有显著性差异(P<0.01)。

　　2.3 MVD、VEGF表达与预后 将患者年龄、性别、TNM临床分期、MVD、VEGF表达等指标进行COX 比例风险回归模型分析，显示MVD是影响NSCLC预后的独立指标，MVD高表达组患者手术后死亡的相对危险度是MVD低表达组患者的34.247倍(似然比检验，P<0.01)。运用KaplanMeier 法对随访资料分析，结果显示NSCLC术后生存期除与TNM临床分期、病理组织学分级、有无淋巴结转移、肿块大小明显相关外，NSCLC术后平均生存时间及中位生存期MVD高表达组明显低于低表达组，VEGF阳性表达组明显低于阴性表达组，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表2,表3。表1 MVD、VEGF表达与临床病理因素的关系与肿块直径≤3 cm组比较：1)P<0.05，与组织分化Ⅰ、Ⅱ级比较：2)P<0.01，与淋巴结转移阳性组比较：3)P<0.01，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期之间两两比较：4)P<0.01表2 MVD与NSCLC生存期的关系对数秩和检验：χ2=43.207，P<0.01表3 VEGF与NSCLC生存期的关系对数秩和检验：χ2=41.131，P<0.01

　　3 讨 论

　　研究表明肿瘤转移是一个多步骤过程，新生的微血管是肿瘤浸润和转移的第一站，随着肿瘤MVD的增加，肿瘤侵袭转移等恶性潜能也明显增加。Wendum〔11〕等报告MVD可作为预测直肠癌转移和复发的一项指标。本研究发现，MVD计数与NSCLC组织学分化程度、淋巴结转移、TNM临床分期相关，组织学分化Ⅲ级明显高于Ⅰ、Ⅱ级;淋巴结转移组明显高于非转移组;TNM临床分期愈晚，MVD计数愈高，说明肿瘤血管增生越活跃，越促进癌细胞的合成代谢，为肿瘤细胞的快速增长及物质代谢提供物质基础，血管生成在NSCLC的发生发展及转移过程中起重要作用，MVD能较好的反映NSCLC 的恶性程度及转移情况。

　　VEGF是促血管活性因子，与受体结合后导致血管内皮细胞分裂增殖、 迁移，促进肿瘤新生血管形成〔12，13〕。本研究中43例NSCLC癌组织中VEGF的阳性表达率为53.5%，并且VEGF阳性表达与瘤体大小、TNM临床分期显著相关，瘤体大、TNM临床分期晚，VEGF阳性表达率高，这可能是由于肿瘤体积愈大，临床分期愈晚，肿瘤组织也愈缺氧，诱导VEGF表达。VEGF阳性表达与NSCLC淋巴结转移也密切相关，淋巴结转移组VEGF阳性表达率高，提示具有转移发展趋向的肿瘤组织中VEGF表达明显增高，VEGF 可促进肺癌早期的浸润转移行为。在本研究中，VEGF阳性表达在不同NSCLC组织分化程度间未显示显著性差异，这或许和各期病例较少有关，还需进一步证实。本研究也观察到VEGF阳性表达与肿瘤组织中的MVD显著增加，两者存在显著正相关，提示VEGF有促进NSCLC 肿瘤血管形成的作用。

　　本研究对43 例NSCLC患者随访5年进行单因素的预后分析，结果显示VEGF表达和MVD计数与患者生存期均显著相关。VEGF阳性组患者平均生存时间明显低于VEGF阴性组，分别为17.4个月和55.5个月;MVD高表达组患者平均生存时间明显低于MVD低表达组，分别为17.2个月和55.5个月;患者中位生存期VEGF阳性组明显低于VEGF阴性组，分别为16.0个月60.0个月; MVD高表达组患者中位生存期明显低于MVD低表达组，分别为16.0个月和60.0个月。患者平均生存时间与中位生存期在VEGF阳性组和阴性组、MVD高表达组和低表达组均具有显著的统计学意义，与文献报道一致〔5，14〕。

　　将年龄、TNM分期、MVD、VEGF等因素进行COX比例风险回归模型分析，显示MVD是影响NSCLC预后的独立指标，MVD高表达组手术后死亡的相对危险度是MVD低表达组的34.247倍。说明MVD较好地反映了肿瘤细胞的侵袭能力，与血管形成促进肿瘤的复发和转移的理论是相吻合的。

　　综上所述，VEGF的表达与MVD相关，MVD和VEGF的表达均与NSCLC的转移密切相关，VEGF表达水平及MVD的检测可以成为NSCLC恶性程度与预后的重要指标，有助于筛选出高危患者，对高表达者应加强随访及术后综合治疗以提高其生存时间和生存质量。

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