C及血管内皮生长因子受体3在高发区食管鳞癌淋巴结转移中的作用

　　 作者：杨增周　　作者单位：林州市人民医院胸外科，河南 林州

　　【摘要】 目的 研究血管内皮生长因子C(VEGFC)及其受体血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)在河南省林州市食管癌高发区食管鳞癌中的表达及其在食管癌淋巴结转移和预后中的作用。方法 83例食管鳞癌患者均为林州市居民,采用免疫组织化学方法检测VEGFC、VEGFR3蛋白在食管鳞癌中的表达情况，随访5 a以上。结果 VEGFC阳性产物位于细胞质，VEGFC阳性表达率为45.8%(38/83)，VEGFC阳性表达与食管癌浸润深度、pTNM分期，局部淋巴结转移相关(P<0.01)。VEGFR3阳性脉管数平均为(9.77±2.99)个，VEGFR3阳性脉管数与淋巴结转移、VEGFC表达之间存在相关关系(P<0.001)。VEGFC阳性表达组5 a生存率明显低于阴性表达组(P<0.01)。结论 VEGFC及其受体VEGFR3可能在食管癌淋巴结转移中发挥重要作用。VEGFC表达可能是影响食管癌患者预后的因素之一。

　　【关键词】 血管内皮生长因子C 血管内皮生长因子受体3 食管鳞癌 淋巴结转移

　　Effect of vascular endothelial growth factorC and vascular endothelial growth factor receptor3 on lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma in high risk area YANG Zengzhou1,XI Hongjun2,Hou Jinrong1 (1.Department of Chest Surgery,the People′s Hospital of Linzhou City,Linzhou 456550,China;2.Department of Chest Surgery,the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College,Weihui 453100,China)

　　Abstract: Objective To study the expression of vascular endothelial growth factorC (VEGFC)and vascular endothelial growth factor receptor3(VEGFR3) on esophageal squamous cell carcinoma and the effect of them on lymph node metastasis and prognosis in high risk area of Linzhou city.Methods Eightythree cases with esophageal squamous cell carcinoma all came from Linzhou city.The expression of VEGFC and VEGFR3 in esophageal squamous cell carcinoma were detected by immunohistochemistry.And all patients were followed up for five years.Results Positive product of VEGFC was detected in the cytoplasm,the positive expression rate was 45.8%(38/83).The positive expression of VEGFC was positively correlated with tumor infiltration depth,pTNM staging and local lymph node metastasis(P<0.01).The mean of positive vessel VEGFR3 was 9.77±2.99.The positive vessel of VEGFR3 was correlated with lymph node metastasis and expression of VEGFC(P<0.001).Five years survival rate of VEGF3 positive expression was lower than that of VEGF3 negative expression(P<0.01).Conclusion VEGFC and VEGFR3 may play important roles in the lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma.The expression of VEGFC may be a prognostic indicator for the patients with esophageal squamous cell carcinoma.

　　Key words: vascular endothelial growth factorC;vascular endothelial growth factor receptor3;esophageal squamous cell carcinoma;lymph node metastasis

　　河南省林州市是世界上食管癌发病率和病死率最高的地区之一，鳞状细胞癌是我国食管癌主要的病理组织学类型。由于缺乏敏感、特异的早期诊断和生物防治的指标和方法，临床上以中、晚期患者为主，其5 a生存率在30%左右，而早期癌可达90%以上[1]。转移和复发是导致患者死亡的主要原因,淋巴转移是食管癌转移的主要途径和预后因素之一[2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是已知最强的促血管内皮细胞增生物质之一[3]，血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factorC，VEGFC)作为VEGF家族中的一员，其特异性作用于位于脉管内皮细胞中的血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor3，VEGFR3)受体，诱导淋巴内皮细胞增殖和淋巴管增生，促进肿瘤细胞的淋巴道转移。作者应用免疫组织化学技术检测VEGFC及其受体VEGFR3在食管鳞癌中的表达，探讨两者在食管鳞癌淋巴结转移中的作用，为临床医师更确切地评估患者预后和实施个体化治疗提供帮助。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 标本来自1998至1999年河南省林州市人民医院胸外科手术切除、病理科存档的食管鳞癌蜡块。以临床病理资料和随访调查资料完整的83例林州市食管鳞癌患者为研究对象。其中，原位癌13例，进展期癌70例;男57例，女26例;年龄38～76岁，平均(59.82±7.42)岁。随访在5 a以上。术前未接受放射或化学治疗等抗肿瘤治疗。

　　1.2 组织处理 所有组织均经体积分数10%福尔马林固定，石蜡包埋。蜡块标本连续4 μm切片，平贴在涂有3氨丙基3己氧基甲硅烷的载玻片上，作免疫组织化学染色。

　　1.3 试剂与方法 兔抗人VEGFC多克隆抗体(ZA0266),工作浓度1100; 兔抗人VEGFR3多克隆抗体(ZA0267),工作浓度1200。采用Pv9000二步法非生物素免疫组织化学检测试剂盒,以上试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。具体操作按说明书严格进行。所有切片均经0.01 mol•L-1柠檬酸缓冲液作高温高压抗原修复。一抗均4 ℃过夜，PBS代替一抗作为空白阴性对照。

　　1.4 结果判定 VEGFC阳性产物定位于细胞质中呈棕黄色染色，每例切片高倍镜下(×40)计数至少5个随机视野，取平均值。阳性细胞数目≤5%为阴性表达,>5%为阳性表达。

　　VEGFR3免疫组织化学染色主要位于脉管内皮细胞，在低倍镜(×10)下寻找VEGFR3阳性脉管密集区，即“热区”(hot spot)，200倍视野计数3个热区中VEGFR3阳性脉管数，取平均值，即该组织的VEGFR3阳性脉管数。肿瘤区内单个或成丛的内皮细胞，不管成腔与否均视为脉管计数，凡伴有肌层的脉管不予计数。

　　1.5 统计学处理 应用SPSS 10.0软件进行数据处理。VEGFC和VEGFR3蛋白表达与临床病理因素之间的关系采用χ2检验或KruskalWallis检验。2个变量相关性分析采用Spearman等级相关分析。对食管癌患者的生存资料进行KaplanMeier分析，生存率比较用Logrank检验。显著性水准α定位0.05。

　　2 结果

　　2.1 免疫组织化学染色结果 VEGFC阳性产物大多数呈细颗粒状弥漫分布于胞质中，83例鳞癌组织中VEGFC阳性表达率为45.8%(38/83)，见图1;VEGFR3阳性产物主要位于癌巢间质中的脉管内皮细胞，未见有癌细胞染色。VEGFR3阳性脉管多数形状不规则，壁薄，管腔内可见癌细胞，见图2。83例食管癌中，VEGFR3阳性脉管数最多16个，最少4个，平均(9.77±2.99)个。

　　2.2 VEGFC表达与食管鳞癌临床病理参数的关系 VEGFC阳性表达在患者不同性别、年龄组、病变部位、分化程度之间的分布差别无统计学意义(P>0.05);但在不同浸润深度、区域淋巴结转移、pTNM分期之间的分布差别有统计学意义(P<0.05)，Spearman等级相关检验显示：VEGFC表达与浸润程度、区域淋巴结转移及pTNM分期显著相关(P<0.05)，见表1。表1 VEGFC表达与食管鳞癌临床病理特征 的关系 △为KruskalWallis检验，r为Spearman等级相关检验。

　　2.3 VEGFR3阳性脉管数与淋巴结转移和VEGFC表达的关系 食管癌有淋巴结转移组的VEGFR3阳性脉管数比无淋巴结转移组明显增多，差异有显著性(t=-2.613,P<0.05)。VEGFR3阳性脉管数在VEGFC表达阴性组和阳性组分别为(8.29±2.62)个和(11.53±2.42)个，2组之间的差别有统计学意义(t=-5.807,P<0.001)。Spearman等级相关检验显示：VEGFR3阳性脉管数目与淋巴结转移、VEGFC表达之间存在相关关系(r=0.526,P<0.001)，见表2。表2 VEGFR3阳性脉管数与VEGFC表达和淋巴结转移的关系

　　2.4 VEGFC表达与食管癌患者预后的关系 38例VEGFC表达阳性患者中37例死于肿瘤复发和转移;45例VEGFC表达阴性患者中4例死于心脑血管意外，17例死于肿瘤复发和转移。KaplanMeier生存分析显示：VEGFC表达阳性组和阴性组患者的平均生存时间(月)及95%可信区间分别为26(23,29)和57(50,64)。VEGFC表达阳性组患者的5 a累积生存率为2.63%，阴性组患者的5 a累积生存率为62%。Logrank检验：阳性表达组的5 a生存率明显低于阴性组，差别有统计学意义(χ2=41.65，P<0.001)。

　　3 讨论

　　VEGFC是VEGF家族的新成员，近年来发现其有促淋巴管增殖作用，故又被称为淋巴管生长因子。它通过作用于淋巴管内皮细胞受体VEGFR3，诱导淋巴内皮细胞分化、增殖和迁徙，导致淋巴管增生[46]，是肿瘤细胞和周围淋巴管内皮细胞之间相互旁分泌的重要调节因素，在淋巴结转移的发生中起重要作用。VEGFC受体有2个:VEGFR2和VEGFR3，都属于酪氨酸激酶受体[7]。VEGFC前体多肽经逐步蛋白酶解后产生的一系列VEGFC多肽均能激活VEGFR3，成熟的VEGFC与VEGFR3的亲和力提高了400倍，在同一组织内，VEGFC结合VEGFR3的亲和力比结合VEGFR2的亲和力高3倍多[8]，所以，VEGFC主要与VEGFR3结合而发挥作用。

　　本研究结果表明，VEGFR3阳性脉管数在VEGFC表达阳性组和阴性组之间有显著性差异，VEGFR3阳性脉管数与VEGFC表达成正相关关系，此结果与Kitadai[9]在食管癌中的研究一致，提示VEGFR3阳性脉管不仅是VEGFC结合作用的部位，VEGFR3阳性脉管亦可视为VEGFC作用的结果，VEGFC上调VEGFR3的表达，两者共同作用促进淋巴管增殖。这与刘丽庭[10]、石小燕[11]在其他肿瘤研究中的结果基本一致。

　　本研究同时发现，VEGFC在淋巴结转移组的阳性率明显高于无转移组;VEGFR3阳性脉管数在淋巴结转移组较无转移组明显增多，与时景文[12]的研究结果一致;两者均与淋巴结转移存在正相关关系。提示食管癌细胞分泌的VEGFC能刺激其受体VEGFR3的表达，并与之结合引起淋巴管生成，促进了肿瘤的淋巴结转移。

　　作为酪氨酸激酶受体的VEGFR3与其配体VEGFC结合后，一方面通过Ras/MAPK酪氨酸激酶受体通路诱导淋巴管内皮细胞有丝分裂，产生细胞增殖效应;另一方面又通过RAFTK信号传导通路，产生细胞的黏附效应并促进内皮细胞的迁移及淋巴管的形成。新生淋巴管与动脉、静脉及毛细血管在结构上有许多不同之处，新生淋巴管由1层极薄的无基底膜的内皮细胞排列而成，这层内皮细胞胞浆高度减少，导致管壁较薄，且淋巴管内皮细胞缺乏紧密连接，故与血管相比，新生淋巴管具有较高的通透性[13]。当肿瘤膨胀生长，间质压力增加，固定淋巴管壁与基质间的锚丝张力增加，从而促使毛细淋巴管管腔扩张，疏松的内皮细胞被拉开，形成开放型内皮通道，使肿瘤细胞随组织液一同经开放的内皮细胞通道进入淋巴管产生转移。另外，淋巴管生成也增加了肿瘤细胞与淋巴管的接触面积，以上因素均使肿瘤细胞容易通过毛细淋巴管壁进入管腔，可见微淋巴管生成促进了肿瘤的淋巴转移。VEGFC/VEGFR3信号通路促进淋巴结转移，也必然影响患者的预后，本组资料分析显示，VEGFC是影响食管癌患者生存的因素之一，支持以上的理论推断。

　　虽然单纯肿瘤淋巴管生成尚不能完全解释肿瘤淋巴道转移的具体机制和全部过程，但VEGFC/VEGFR3信号通路是肿瘤淋巴转移的重要机制及环节，Shimizu等[14]通过阻断VEGFR3减少了鼠胃癌模型中的淋巴管密度和淋巴结转移，因此对VEGFC/VEGFR3信号通路的抑制研究可能是抗肿瘤淋巴管转移治疗的一种新方法。

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