慢性脑低灌注大鼠海马CA1区VEGF和磷酸化tau蛋白的表达及意义

　　作者：鲁远君 余昌胤 作者单位：遵义医学院附属医院神经内科，贵州 遵义 563003

　　【摘要】目的 观察慢性脑低灌注大鼠海马CA1区血管内皮生长因子(VEGF)和磷酸化tau蛋白的表达及意义。方法 将SD大鼠随机分为正常对照组(对照组)、假手术组和模型组。采用永久性结扎双侧颈总动脉建立慢性脑低灌注模型(2VO);实验开始后1、2、3月，应用免疫组织化学染色法检测海马CA1区VEGF和磷酸化tau蛋白的表达。结果 与对照组和假手术组比较，模型组海马CA1区VEGF表达在1、2月时明显增高(P<0.05)，3月时各组间表达差异无显著性(P>0.05)。磷酸化tau蛋白表达在1月时各组间差异无显著性(P>0.05);2和3月时，模型组表达较对照组和假手术组明显增高(P<0.05)。结论 慢性脑低灌注时VEGF表达增高可能是一种自身保护机制，磷酸化tau蛋白参与了慢性脑低灌注认知功能损伤过程。

　　【关键词】 慢性脑低灌注;血管内皮生长因子;磷酸化tau蛋白;海马;大鼠

　　The expression of VEGF and phosphorylated tau protein in hippocampal CA1 in the rats with chronic cerebral hypoperfusion

　　LU YuanJun, YU ChangYin.

　　Department of Neurology, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, Guizhou, China

　　【Abstract】 Objective To observe the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and phosphorylated tau protein in hippocampal CA1 in the rats with chronic cerebral hypoperfusion and their significance. Methods SD rats were randomly divided into normal control, sham operation and model groups. The chronic cerebral hypoperfusion model was established by permanent occlusion of bilateral common carotid arteries (2VO). The expression of VEGF and phosphorylated tau protein in hippocampal CA1 were detected with immunohistochemistry at 1, 2 and 3 months aftet 2VO. Results Compared with normal and sham operation groups, model group had the significantly increased expression of VEGF at 1 and 2 month after 2VO (P<0.05), but there was no difference at 3 month after 2VO (P>0.05). Compared with normal control and sham operation groups, model group had no obviously different expression of phosphorylated tau protein at 1 month after 2VO (P>0.05), but had significant increase at 2 and 3 month after 2VO(P<0.05). Conclusions Increment of VEGF in hippocampal CA1 may be a selfprotection mechanism and abnormal phosphorylated tau protein is connected with cognitive impairment in the rats with chronic cerebral hypoperfusion .

　　【Key words】 Chronic cerebral hypoperfusion; Vascular endothelial growth factor; Phosphorylated tau protein; Hippocampi; Rat

　　慢性脑低灌注性认知功能障碍是中老年人生活质量下降的原因之一。Tau蛋白异常过度磷酸化被认为是阿尔茨海默病(AD)发病的重要因素，早期AD患者脑脊液中磷酸化tau蛋白水平增加〔1〕。同时，AD患者血清VEGF水平减少能导致神经系统变性的进行〔2〕。但是慢性脑低灌注性认知功能下降是否与磷酸化tau蛋白及VEGF有关尚未明了。本实验通过结扎大鼠双侧颈总动脉制备慢性脑低灌注模型，采用免疫组化观察大鼠海马CA1区VEGF和磷酸化tau蛋白的表达，探讨慢性脑低灌注导致认知功能障碍的发病机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　健康SD大鼠45只，清洁级，鼠龄8～10 w，体重250～300 g，雌雄不拘，由第三军医大学实验动物中心提供(动物中心许可证号：SCXK(渝)20020003)。采用随机将大鼠分为：正常对照组(对照组)、假手术组和模型组，观察时间点为实验开始后1、2、3月，每个时间点每组5只。实验期间出现大鼠死亡的组别补足相应例数。

　　1.2 主要药品、试剂及设备

　　PS202tauⅠ抗购自Chemicon公司，VEGF Ⅰ抗购自美国Santa Cruz公司;Mias图像分析系统，系四川大学图像分析研究所产品。

　　1.3 模型制作方法

　　大鼠适应性喂养1 w后，采用Morris水迷宫淘汰学习记忆能力太差和太好的大鼠。参照de la Torre报道的永久性结扎双侧颈总动脉的方法制作慢性脑低灌注模型，假手术组除不结扎双侧颈总动脉外，其余手术过程同模型组;对照组不作任何处理。

　　1.4 取材

　　实验开始后1、2、3月在Morris水迷宫实验后，用10%水合氯醛2 ml腹腔注射深度麻醉大鼠，将大鼠仰卧位固定，开胸暴露心脏，用生理盐水和4%的多聚甲醛灌注固定，取脑置于10%的多聚甲醛溶液固定48～72 h，在视交叉前后约2 mm取冠状位脑组织，石蜡包埋。

　　1.5 VEGF和磷酸化tau蛋白免疫组织化学染色

　　每只大鼠连续取2张约5 μm厚的切片，分别进行VEGF和磷酸化tau蛋白免疫组织化学染色。VEGF或磷酸化tau蛋白抗体稀释度为1∶100。操作严格按说明书进行，苏木素复染，中性树胶封片。

　　1.6 图像分析

　　采用Mias图像分析系统，胞浆呈棕黄色染色为VEGF、磷酸化tau蛋白阳性细胞，检测各组1、2、3月时海马CA1区VEGF、磷酸化tau蛋白的表达。每张切片在400倍下取3个视野，测定分析视场的平均灰度值。

　　1.7 统计学处理

　　各实验组数据均采用SPSS11.5统计软件包处理，数据以x±s表示，采用q检验进行统计分析。

　　2 结 果

　　2.1 组织病理学改变

　　HE染色见对照组和假手术组大鼠大脑皮质及海马区神经细胞形态及分布正常。模型组在1月时无明显变化，但2、3月时海马CA1区锥体细胞出现变性，数量减少、排列疏松，部分神经元脱失。

　　2.2 VEGF免疫组织化学染色结果

　　对照组、假手术组大鼠无VEGF阳性表达。模型组大鼠脑皮质、海马区VEGF见阳性表达，以海马CA1区表达最为显著，主要分布于神经元内、内皮细胞及软脑膜。实验开始1、2月，模型组VEGF表达较对照组和假手术组明显增加，差异显著(P<0.05)，3月时各组间表达无显著差异(P>0.05)。见表1。

　　2.3 磷酸化tau蛋白免疫组织化学染色结果

　　对照组、假手术组大鼠无磷酸化tau蛋白阳性表达，模型组磷酸化tau蛋白阳性表达主要见于胞浆、轴突。阳性细胞分布以海马最多，其次为脑皮质。磷酸化tau蛋白表达在1月时各组间无明显差异(P>0.05);2、3月时，模型组表达较对照组和假手术组明显增加 (P<0.05);各组磷酸化tau蛋白表达的平均灰度值见表1。表1 各组大鼠海马CA1区VEGF及磷酸化tau蛋白表达的平均灰度值(略)

　　3 讨 论

　　慢性脑低灌注大鼠海马神经元变性、坏死和脱失，导致空间学习记忆能力的显著下降〔3〕。应用Morris水迷宫检测定位航行潜伏期和空间探索次数，结果显示慢性脑低灌注大鼠在造模后2月和3月出现定位航行潜伏期延长和空间探索次数减少〔4〕，与本实验中海马神经元的减少一致，表明海马神经元的减少与慢性脑低灌注大鼠的认知功能障碍有关。

　　VEGF是由许多正常细胞产生和分泌的血管形成因子。VEGF与其血管内皮细胞上特异性受体结合后，通过受体的作用促进微血管内皮细胞分裂、增殖，促进侧支循环的建立。在慢性脑低灌注状态，VEGF蛋白可持续性表达，与血管生成有一定关系〔5〕。本实验结果表明，在大鼠慢性脑低灌注后1、2月时VEGF表达最明显，3月时与对照组无显著差异。推测慢性脑低灌注后1、2月时VEGF表达增加可能与其促进血管生成，改善血液供应有关。VEGF对神经系统的作用远不局限于调节血管的形成,脑缺血时，VEGF对神经系统具有多重保护作用,腺病毒AAVH9可以将VEGF基因携至缺血脑组织中，通过抗神经细胞凋亡的途径产生对神经的保护作用〔6〕。另有文献报道，慢性脑低灌注后，GAP43、MAP2和轴突素表达降低〔7〕，而VEGF能刺激轴突生长，推测1月时VEGF表达增加可能还与轴突生长有关。早期VEGF表达增加，参与破坏血脑屏障，促进脑水肿形成〔8〕。

　　Tau蛋白是神经元内的一种微管相关蛋白，具有促进微管蛋白组装成微管，稳定已经组装的微管，并参与维持细胞形态、细胞内物质转运、细胞有丝分裂等过程，是轴突生长发育不可缺少的因素。Tau蛋白的功能由其磷酸化状态调节，Tau蛋白过度磷酸化后与微管蛋白的结合力降低，导致正常情况下稳定微管和促进微管蛋白聚合形成微管的作用消失〔9〕。本实验结果显示，磷酸化tau蛋白在慢性脑低灌注大鼠脑内的分布以海马最多，其次是脑皮质;在细胞内主要表达于胞浆和神经轴突，以轴突表达最为明显。从表达的时间上分析，1月时表达不明显，2月和3月表达逐渐增加，磷酸化tau蛋白表达增加可能是导致慢性脑低灌注大鼠认知功能障碍的原因之一。

　　结果证实，造模后1月时认知功能无明显异常，2月和3月后认知功能逐渐降低，而VEGF的1月时表达最明显，此后逐渐降低，其原因可能是模型组的表达增加与慢性脑缺血刺激诱导VEGF表达有关。尽管1月时VEGF表达增加促进血管形成及神经保护作用，但由于其他因素如tau蛋白异常磷酸化等因素继续存在，故大鼠的认知功能在2月和3月时持续下降。

　　【参考文献】

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