乙酰肝素酶在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

　　作者：宋永彬,王志康,柳立军,王会恩,周韶辉　　作者单位：050051 石家庄市，河北省人民医院胸外科

　　【摘要】 目的 探讨乙酰肝素酶(Hpa)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其与NSCLC临床病理特征间的关系。方法 应用RTPCR 和免疫组化方法检测52 例NSCLC术后组织标本及相应癌旁组织中Hpa的表达，分析Hpa表达与NSCLC临床病理特征的关系。结果 NSCLC组织中存在Hpa基因的表达，并定位于肿瘤细胞质和(或)细胞膜中。52例NSCLC组织中有39例Hpa基因mRNA 表达阳性(39/52，75%)，癌旁组织有11例表达阳性(11/52，21.2%)，2组间差异有统计学意义(P<0.01)。免疫组化染色NSCLC组织中Hpa阳性率69.2%(36/52)，癌旁组织阳性率17.3%(9/52)，2组间差异有统计学意义(P<0.01)，Hpa基因mRNA和蛋白质的检测均显示腺癌癌组织Hpa表达高于鳞癌，有淋巴结转移的癌组织表达高于无淋巴结转移组，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期的癌组织表达高于Ⅰ～Ⅱ期，差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 NSCLC组织Hpa基因及蛋白表达高于正常组织，并且与NSCLC的转移和进展有密切关系。

　　【关键词】 癌，非小细胞肺;乙酰肝素酶;淋巴转移;肿瘤分期

　　Expression and clinical significance of heparanase in the tissue of human nonsmall cell lung cancer SONG Yongbin,WANG Zhikang,LIU Lijun,et al.Department of Thoracic Surgery,Hebei Provincial People’s Hospital,Shijiazhuang 050051,China

　　【Abstract】 Objective To investigate the expression and clinical significance of heparanase in the tissue of nonsmall cell lung cancer(NSCLC)and the relationship between heparanase expression and clinical pathological features. Methods Expression of heparanase gene in 52 resected surgically NSCLC tissues and adjacent normal lung tissues were detected by RT-PCR assay and immunohistochemical staining. Then the relationship between heparanase expression and clinical pathological features of NSCLC was analyzed.Results The expression of heparanase gene and protein was observed in NSCLC tissues. Heparanase protein was located in tumor cell cytoplasm and/or cell membrane. The rate of heparanase mRNA expression in cancer tissues (39/52, 75%)was significantly higher than that (11/52,21.2%) in adjacent normal tissues(P<0.01). The rate of heparanase protein expression in cancer tissues(36/52,69.2%)was significantly higher than that(9/52,17.3%)in adjacent normal tissues(P<0.01).Heparanase expression was correlated to histology,lymphatic metastasis and TNM stages(P<0.01). Conclution Heparanase is overexpressed in cancerous tissues,as compared with adjacent tissues. The expression of heparanase is correlated to metastasis and development of NSCLC.

　　【Key words】 nonsmall cell lung cancer;heparanase; lymphatic metastasis; neoplasm staging

　　近年来，肺癌的多学科综合治疗达到了一个新的水平，但肺癌的远期治疗效果仍不尽人意。研究提示治疗失效的主要原因是肿瘤的复发和转移。肿瘤侵袭、转移是恶性肿瘤最重要也是最本质的生物学特征，是引起恶性肿瘤患者预后不良和死亡的主要原因。乙酰肝素酶(heparanase， Hpa)可特异性降解细胞外基质和基底膜的主要成分——硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，并且协同多种因子直接和间接地促进肿瘤的侵袭和转移。Hpa 在多种恶性肿瘤中表达水平高于其来源的正常组织，但非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)组织中Hpa 表达情况研究较少。为此，本实验研究了NSCLC患者术后癌组织标本中Hpa mRNA表达情况，分析其表达与临床病理因素的关系，评价Hpa在人NSCLC侵袭和转移中的作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 52例非小细胞肺癌组织取自河北省人民医院2005年9月至2007年12月收治的非小细胞肺癌患者，均经手术治疗，病理学确诊，术前未接受化疗及放疗。每例均取癌组织以及癌旁组织(距离癌灶5 cm 处的正常肺组织)，有淋巴结转移的病例同时取其肿大淋巴结。其中男37例，女15例;年龄37～78岁，平均年龄58岁;按WHO《肺肿瘤组织学分型》(1981)标准分类：鳞癌30例，腺癌22例;低分化癌18例，中分化癌22例，高分化癌12例;pTNM分期(国际UICC 1997分期标准)：Ⅰa期2例，Ⅰb期4例，Ⅱa期7例，Ⅱb期10例，Ⅲa期14例，Ⅲb期11例，Ⅳ期4例;淋巴结转移40例。每例标本分为2份，一份液氮保存，提取组织RNA;另一份4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，行免疫组织化学染色。

　　1.2 Hpa基因引物 上游序列：5’TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC3’，下游序列：5’GTAGTGATGCCATGTAACTGAAT

　　C3’538;采用βactin 作8为内参对照，引物序列上游：5’ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG 3’，下游：5’CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACA TCTGC3’。以上引物均由上海生物工程公司合成。

　　1.3 PCR 扩增 组织经液氮研钵匀浆后使用Trizol( InVitrogen 公司)RNA 分离试剂提取总RNA。经紫外分光光度计测定，RNA 提取物D 260/D 280均在1.8～2.0。取2 μg RNA 进行常规RTPCR 反应。反应条件为：37℃ 逆转录60 min，94℃ 5 min 预变性;随后进入94℃ 60 s，57℃ 60 s，72℃ 60 s 循环。35次循环后72℃ 延伸5 min。以无菌双蒸水代替RNA模板扩增为PCR空白对照。取5 μl扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳，DNA 凝胶成像扫描仪(美国fotodyne公司)摄像，进行光量子强度分析，Hpa与βactin 比值作为Hpa 表达水平的参数。

　　1.4 免疫组化染色 采用SP 法进行免疫组织化学染色(兔抗人Hpa 多克隆抗体购自武汉博士德公司，免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司)，按说明书要求进行染色，PBS代替一抗作为阴性对照。结果以上皮组织和间质中细胞膜或细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。

　　1.5 统计学分析 应用SPSS 12.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 NSCLC及癌旁组织中Hpa mRNA表达 Hpa基因扩增产物为538 bp，NSCLC组织中Hpa mRNA阳性率75.0%(39/52)，癌旁组织阳性率21.2%(11/52)，ESCC组织表达高于对照癌旁组织，2组差异有统计学意义(χ2=30.199，P<0.01)。内参基因βactin扩增产物为621 bp，所有组织中均有稳定表达。Hpa mRNA表达阳性率与肿瘤的病理类型，分化程度，淋巴转移和TNM分期有关，与患者的性别、年龄和肿瘤的大小无明显相关性。见表1。

　　2.2 NSCLC及癌旁组织中Hpa蛋白表达 癌组织中Hpa阳性表达多见癌细胞膜和(或)细胞质中出现棕黄色染色胞浆内呈颗粒样，在癌巢边缘处肝素酶显色较强。在肺癌间质不被染色。癌旁肺组织中，肝素酶在支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞中为阴性表达，在血管内皮细胞、平滑肌细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞中呈不同强度的表达。NSCLC组织Hpa阳性率69.2%(36/52)，癌旁组织阳性率17.3%(9/52)。NSCLC组织表达高于对照癌旁组织，2组差异有统计学意义(χ2=27.110，P<0.01)。Hpa蛋白表达阳性率同样与肿瘤的病理类型，分化程度，淋巴转移和TNM分期有关，与患者的性别、年龄和肿瘤的大小无明显相关性。

　　3 讨论

　　肿瘤转移的两个必需条件为瘤细胞侵犯基底膜、细胞外基质和肿瘤血管生成。硫酸肝素蛋白多糖是细胞外基质的主要成分之一并与其它细胞外基质的主要成分密切协同形成肿瘤表1 NSCLC组织中HPa 表达与临床病理特征间的关系注：与中高分化比较，*P<0.01;与无淋巴结转移比较，#P<0.01;与鳞癌比较，△P<0.01;与Ⅰ～Ⅱ期比较，☆P<0.01

　　细胞转移的重要屏障。Hpa的作用为降解硫酸肝素蛋白多糖的硫酸肝素侧链，进而破坏其转移屏障的作用[1]。在正常情况下肝素酶主要见于血小板、胎盘滋养叶母细胞和白细胞，在胚胎形态生成期、创伤愈合、组织修复和炎症过程中起着重要的生理功能作用。研究表明，在子宫颈癌、骨肿瘤、口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌以及乳腺癌和胰腺癌中，均呈Hpa高表达[2-7]。而且，胰腺癌患者术后存活时间与Hpa表达水平的增加呈显著的负相关[7]。故Hpa 被认为是多种肿瘤恶性浸润和转移的重要标志。

　　本研究结果提示NSCLC肝素酶转录水平和翻译水平的表达均非常显著地高于癌旁组织;肝素酶表达与NSCLC的组织学类型、淋巴转移、TNM临床分期和肿瘤分化程度有密切关系，而与患者的年龄、性别、肿瘤大小无明显关系。肝素酶转录水平和翻译水平表达率在淋巴结转移组、Ⅲ期+Ⅳ期组、低分化组分别显著高于无淋巴结转移组、Ⅰ期+Ⅱ期组、中高分化组。提示肝素酶表达与NSCLC的组织学类型、淋巴结转移、TNM临床分期和较低肿瘤分化程度呈正相关，由此可以推测肝素酶可能与NSCLC的转移潜力有关，研究还表明肝素酶与NSCLC的分化程度密切相关，肝素酶表达水平越高NSCLC的恶性程度越高。

　　综上所述，Hpa可作为非小细胞肺癌转移、复发的重要指标之一，有必要进行进一步研究，从而揭示其作用机制和应用价值。

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