不同压力二氧化碳气腹对胃癌细胞增殖运动的影响

　　作者：郝迎学,钟华,曾冬竹,石彦,饶芸,周立新　　作者单位：重庆，第三军医大学西南医院普通外科、微创胃肠外科中心(郝迎学、曾冬竹、石彦、饶芸、周立新、余佩武)，超声科(钟华)

　　【摘要】 目的 通过体外模拟气腹环境，观察不同压力CO2对胃癌细胞MKN45增殖、运动的影响。方法 将MKN45细胞置于充满CO2的密闭培养箱中，按CO2压力不同分为对照组、0、5、10和15 mm Hg组(1 mm Hg=0.133 kPa)，作用时间均为4 h。用血气分析仪检测培养液pH值;MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞仪观察细胞周期变化;Transwell法观察细胞迁移运动变化。结果 0、5、10和15 mm Hg组细胞培养液在0 h呈酸性。MTT法检测细胞增殖发现0、5、10 mm Hg组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，15 mm Hg组与对照组比较吸光度(OD)值在1～3 d差异无统计学意义(t=0.625,-0.537,0.137,P>0.05)，在4～7 d差异有统计学意义(t=26.622,13.376,18.839,7.595,P<0.01)。0、5、10 mm Hg组细胞增殖指数和细胞穿过滤膜的数量与对照组比较差异无统计学意义(t=1.134,-0.538,-0.829;t=0.330,0.794,0.508,P0.05)，15 mm Hg组与对照组比较差异有统计学意义(t=11.225,8.775,P0.01)。结论 在15 mm Hg压力下，CO2对MKN45细胞增殖、运动起抑制作用。

　　【关键词】 气腹; 胃肿瘤; 细胞增殖; 细胞周期; 细胞运动

　　Effects of CO2 pneumoperitoneum with different pressures on proliferation and motility of gastric cancer cells MKN45 HAO Yingxue, ZHONG Hua, ZENG Dongzhu, SHI Yan, RAO Yun, ZHOU Lixin, YU Peiwu. Department of General Surgery and Center of Microinvasive Gastrointestinal Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of CO2 pneumoperitoneum with different pressures on the proliferation and motility of cultured human gastric cancer cell line MKN45 in vitro. Methods According to different CO2 pressures, gastric cancer cell line MKN45 was divided into 0 mm Hg group, 5 mm Hg group, 10 mm Hg group, 15 mm Hg group and control group. The pH value of cell culture medium, proliferation, changes of cycle and migration of gastric cancer cells was detected by blood gas analyzer, MTT assay, flow cytometry and Transwell method, respectively 4 hours later after CO2 insufflation. Results The pH values of culture medium in 0 mm Hg, 5 mm Hg , 10 mm Hg and 15 mm Hg group were lower than 7 at hour 0. No statistical difference of gastric cancer cell proliferation was seen between 0 mm Hg, 5 mm Hg, 10 mm Hg group and control group (P0.05). The difference of optical density had no statistical difference between 15 mm Hg group and control group from day 1 to day 3 (t=0.625, -0.537, 0.137, P0.05), but had statistical difference from day 4 to day 7 (t=26.622, 13.376, 18.839, 7.595,P0.01). In regard of cell proliferation and number of cells migrated through the filter membrane, there was no statistical difference between groups 0 mm Hg, 5 mm Hg, 10 mm Hg and control group (t=1.134, -0.538, -0.829; t=0.330, 0.794, 0.508, P0.05), but significant statistical difference between 15 mm Hg group and control group (t=11.225, 8.775, P0.01). Conclusions CO2 pneumoperitoneum has inhibitory effect on proliferation and motility of gastric cancer cell line MKN45 under 15 mm Hg pressure.

　　【Key words】 Pneumoperitoneum; Stomach neoplasm; Cell proliferation; Cell cycle; Cell motility

　　腹腔镜胃癌根治术治疗早期胃癌已取得满意的近、 远期效果[1]。但对肿瘤已侵及浆膜的进展期胃癌是否可施行腹腔镜胃癌根治术仍存在不同看法。主要原因是该手术是否会促进胃癌细胞的播散转移尚有争论，特别是作为常用气腹介质CO2对胃癌细胞生物学行为的影响目前仍不十分清楚。本研究应用CO2体外模拟气腹环境，观察其对胃癌细胞增殖运动的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养及分组

　　胃癌MKN45细胞(购自第四军医大学西京医院全军消化研究所)常规培养于RPMI 1640培养液中。实验分为5组，对照组：培养板直接放入37 ℃、5% CO2孵箱中;0 mm Hg组：将培养板置于充满CO2的压力箱中， 调节压力为0 mm Hg; 5、10、15 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)组则将培养板分别置于压力为5、10、15 mm Hg的压力箱中。5组孵育时间均为4 h。

　　1.2 体外模拟CO2气腹环境的建立

　　将60 cm×40 cm×30 cm的密闭保鲜箱改造成密闭培养箱，侧壁的一面靠近底部开有一个进气孔，另一面靠近顶部处开有一个出气孔;进气孔通过一根橡胶软管与气腹机出气口相连，气腹机进气口与高纯度的CO2钢瓶减压阀相连。建立CO2气腹时通入高纯度CO2(流量为5～8 Lmin)持续1 h。1 h 后如气体分压仪显示压力箱内的CO2浓度>99%，即说明压力箱内已达到纯CO2的条件。此时可关闭出气孔，调整气体流量至需要的压力并保持。

　　1.3 血气分析仪测定培养液pH值

　　将处于对数生长期的MKN45细胞消化、重悬，调整细胞浓度为2.0×105个ml。分别取1 ml加入24孔培养板中，每孔含细胞2.0×105个。置入密闭培养箱内培养4 h，分别于排气后0、2、4、6、10 h取各组培养液各1 ml，用血气分析仪测pH值，每组4孔，取均值。

　　1.4 MTT法检测细胞增殖活性

　　调整细胞浓度为1.0×104个ml，分别取200 μl加入96孔培养板中。分别于排气后第1～7天检测细胞增殖活性，于检测前4 h在96孔培养板中分别加入MTT溶液20 μl，4 h后吸出培养液和MTT溶液，再分别加入150 μl二甲基亚砜，混匀后于酶标仪490 nm测吸光度(OD)值，每天测8个复孔，取均值。

　　1.5 流式细胞仪检测细胞周期变化

　　用流式细胞仪检测细胞周期前，振荡器使细胞分散并将细胞滴入75%乙醇，边滴边振荡，放入4 ℃冰箱固定12 h，加入碘化丙啶，置500目尼龙网过滤，再用流式细胞仪分析。

　　1.6 Transwell法检测细胞迁移率

　　细胞消化、重悬、分组同血气分析。用不含血清的培养液调整细胞浓度为2.0×105个ml，取400 μl含细胞的无血清培养液放入Boyden小室中，将小室置入预先加入600 μl含10%血清培养液的24孔培养板中，常规培养6 h后将培养板置入压力培养箱中，4 h后取出培养板再常规培养6 h，甲醇固定，苏木精染色，400倍显微镜随机选取5个视野计数迁移至下层小室细胞数，取均值。

　　1.7 统计学分析

　　计量资料以±s表示，采用SPSS 10.0统计软件进行独立样本t检验及单因素方差分析F检验。P0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 培养液pH值变化

　　0、5、10和15 mm Hg组与对照组比较，处理后0 h培养液pH值明显降低，压力越大，降低越明显;连续检测处理后第2、4、6、8、10小时，发现在移至正常培养环境后，各组pH值很快恢复正常，其中15 mm Hg组恢复最慢，为处理后6 h恢复正常(图1)。

　　图1 不同压力下各组细胞培养液pH值随时间的变化

　　2.2 细胞增殖活性变化

　　0、5、10 mm Hg组与对照组OD值比较差异无统计学意义(P>0.05);15 mm Hg组与对照组OD值比较在1～3 d差异无统计学意义(t=0.625，-0.537，0.137,P>0.05)，在4～7 d下降非常显著，差异有统计学意义(t=26.622，13.376，18.839， 7.595，P<0.01)。

　　2.3 细胞周期变化

　　根据流式细胞仪分析结果计算各组细胞增殖指数(profile index，PI)，计算公式为PI=(S+G2G1+S+G2+M)×100%。结果0、 5、 10 mm Hg组与对照组PI比较差异无统计学意义 (t=1.134， -0.538，-0.829，P>0.05);15 mm Hg组PI明显小于对照组，差异有统计学意义(t=11.225，P<0.05)。

　　2.4 细胞迁移率变化

　　0、5、10 mm Hg组细胞处理后6 h穿过滤膜的数量分别为123±18.28、133±10.31、126±6.50，与对照组的122±21.93比较差异无统计学意义(t=0.330，0.794，0.508，P>0.05);15 mm Hg组为22±12.87， 较对照组明显减少(t=8.775，P<0.01)(图2，3)。

　　3 讨论

　　虽然腹腔镜胃癌手术时间较传统开腹手术长，但因有术后疼痛轻、胃肠功能恢复快、住院时间短、腹壁瘢痕小及对机体免疫功能影响小等优点，显示了腹腔镜手术的优越性[2-3]。我科自2004年3月开展腹腔镜胃癌根治术以来，已行腹腔镜胃癌根治术302例，其中进展期胃癌236例，近期效果良好。在肿瘤切除范围、淋巴结清扫数目等方面与开腹手术无明显差别[4]。

　　但是，目前进展期胃癌行腹腔镜胃癌根治术发展仍然缓慢，主要原因是对腹腔镜手术是否会促进肿瘤细胞在腹腔内播散及戳孔种植转移存在争议。目前，有关CO2气腹对肿瘤细胞生物学行为影响的报道很不一致。Takiguchi等[5]报道CO2气腹会促进肿瘤细胞的增殖和生长，包括结直肠癌、腺癌和其他恶性肿瘤。Leng等[6]报道体外模拟CO2气腹环境，培养的卵巢癌HO8910细胞和SKOV3细胞会随着压力的升高、时间的延长，其凋亡的比例增加。徐春阳等[7]报道在CO2气腹条件下，早期抑制子宫内膜癌HTB113细胞的生长，而在处理后的5～12 d促进癌细胞的生长。Gutt等[8]报道在充气后1～4 d胰腺癌细胞DANG和结肠癌细胞CX2生长明显受到抑制，而在第5～15天两种癌细胞增殖明显加快，DANG细胞的增殖独立于气腹压力，而CX2细胞的增殖则依赖于CO2的压力。我们的研究发现，胃癌细胞MKN45在低CO2压力条件下，其增殖活性与对照组比较差异无统计学意义，而在15 mm Hg条件下其增殖活性明显低于对照组。我们对细胞培养液的pH值检测中发现，15 mm Hg组细胞培养液pH值变化较大，恢复正常需要约6 h。其机制可能为在严重缺氧状态下，缺氧诱导因子1α磷酸化与HIF1β分离，和P53结合促进细胞凋亡的发生[9]。

　　我们在实验中还发现，在0、5、10 mm Hg组MKN45细胞迁移通过Boyden小室8 μm滤膜的数目较对照组稍多，但差异无统计学意义。而15 mm Hg组MKN45细胞迁移率明显少于对照组(P<0.01)。我们分析这可能与15 mm Hg组细胞大部分发生凋亡有关，而较高压力是否会影响肿瘤细胞的运动能力还需要进一步研究。

　　我们的研究结果显示，在临床常用的气腹压力(≤10 mm Hg)下CO2不会促进胃癌细胞的生长和迁移，而在较高气腹压力(15 mm Hg)下CO2抑制胃癌细胞的增殖和运动。

　　【参考文献】

　　[1] Huscher CG, Mingoli A, Sgarzini G, et al. Laparoscopic versus open subtotal gastrectomy for distal gastric cancer fiveyear results of a randomized prospective trial. Ann Surg,2005,241(2)232-237.

　　[2] 余佩武，罗华星.腹腔镜下胃癌D2根治术.消化外科，2006，5(4)：227-230.

　　[3] 中华医学会外科学分会腹腔镜与内镜外科学组.腹腔镜胃癌手术操作指南(2007版).中华消化外科杂志，2007，6(6)：476-480.

　　[4] Wang ZQ, Qian F, Cai ZM, et al. Comparison of laparoscopically assisted and open radical distal gastrectomy with extended lymphadenectomy for gastric cancer management. Surg Laparosc Endosc,2006,20(11)1738-1743.

　　[5] Takiguchi S, Matsuura N, Hamada Y, et al. Influence of CO2 pneumoperitoneum during laparoscopic surgery on cancer cell growth. Surg Endosc,2000,14(1)41-44.

　　[6] Leng J, Lang J, Jiang Y, et al. Impact of different pressures and exposure times of a simulated carbon dioxide pneumoperitoneum environment on proliferation and apoptosis of human ovarian cancer cell lines. Surg Endosc,2006,20(10)1556-1559.

　　[7] 徐春阳，梁志清，熊光武.二氧化碳人工气腹对子宫内膜癌细胞体外生长的影响.中华妇产科杂志,2003，38(12)766-767.

　　[8] Gutt CN, Kim ZG, Hollander D, et al. CO2 environment influences the growth of cultured human cancer cells dependent on insufflation pressure. Endosc Surg,2001,15(3)314-318.

　　[9] Suzuki H, Tomida A, Tsuruo T. Dephosphorylated hypoxiainducible factor 1alpha as a mediator of p53dependent apoptosis during hypoxia. Oncogene,2001,20(41)5779-5788.