外膜涂抹益气活血方防治静脉移植物再狭窄的实验研究

　　作者：谢鹏,刘志勇,徐俊华　　作者单位：1.东南大学 临床医学院,江苏 南京 210009;2.东南大学附属中大医院 心胸外科,江苏 南京

　　【摘要】 目的 探讨术中局部应用益气活血方对自体移植静脉再狭窄的影响及其作用机制。方法 建立家兔颈总动脉自体颈外静脉移植模型，随机分为:(1)A组，手术组;(2)B组，手术+抹胶(pluronicF127 gel)组;(3)C组，手术+抹益气活血方剂(由黄芪、川穹、三七组成)组,益气活血方由pluronicF127gel携带，涂抹于静脉移植物外膜。分别于术后7、14、28 d用免疫组织化学方法检测移植静脉增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况;HE、Masson染色后应用计算机图像分析系统检测术后14 d移植静脉内膜、中膜增生情况及内膜厚度/中膜厚度(I/M)值;应用流式细胞仪检测移植静脉DNA含量,观察血管平滑肌细胞(VSMC)的细胞周期，确定各期细胞所占的百分比。结果 术后14 d，C组移植静脉内膜厚度、中膜厚度、I/M值明显低于A组和B组，差异有统计学意义(P<0.05);术后7、14、28 d，C组的VSMC增殖率低于A组和B组，差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪分析，C组G0/G1、S、G2/M期细胞所占比例逐渐减少，A组和B组G0/G1、S、G2/M期细胞所占比例逐渐增多，与C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 用pluronicF127 gel携带益气活血方涂抹自体移植静脉外膜可使移植静脉内膜、中膜增生减轻，对防治静脉移植物术后早期再狭窄有良好作用，其机制可能在于益气活血方能显著抑制VSMC的过度迁移增殖，减少细胞外基质的大量合成，从而减轻移植静脉内膜、中膜增生，对抗血管重构。

　　【关键词】 益气活血方;静脉移植物;血管再狭窄;增殖细胞核抗原;流式细胞仪;家兔

　　Study on the prevention of autologous vein graft restenosis by smearing

　　Yiqihuoxue Prescription on the testing vessel adventitia

　　XIE Peng1，LIU Zhiyong2，XU Junhua1(1.Clinical Medical School，Southeast University，Nanjing 210009，China;2.Department of Cardiothoracic

　　Surgery，Zhongda Hospital,Southeast University，Nanjing 210009，China)

　　Abstract:Objective To investigate the effect of smearing Yiqihuoxue Prescription locally in the management of vein graft failure and its mechanism.Methods A rabbit model of jugular veins grafted into the common carotid arteries was built.Animals were randomly divided into operation group(group A),operation + smearing pluronicF127 gel group(group B) and operation + Yiqihuoxue Prescription group(group C).Yiqihuoxue Prescription mixed with pluronicF127 gel was smeared on the adventitia of autologous vein grafts in group C.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA) were localized in 7,14,28 days by immunohistochemical procedure.Fourteen days after the operation，the thickness of neointima and media and neointima/media (I/M) were calculated from the sections stained with HE and Masson by computer image analysis.Flow cytometry was used to detect the DNA content and the ratio of cell cycles.Results The thickness of neointima，media and I/M in group C were significantly less than those in group A and B fourteen days after the operation(P<0.05).The proliferating rate of vascular smooth muscle cell in group C decreased more significantly than those in group A and B in 7,14,28 days after operation.Analysis of flow cytometry showed that the ratio of cells in G0/G1,S，G2/M phase decreased gradually in group C and increased gradually in A and B group(P<0.05).Conclusion Smearing Yiqihuoxue Prescription mixed with the pluronicF127 gel on the autologous vein grafts can inhibit the proliferation of the vessel proliferating cells，at least partly by inhibiting the adventitia activation，alleviating the hyperplasia of both neointima and media.It is an operative therapeutic method to prevent the autologous vein grafts restenosis by smearing Yiqihuoxue Prescription with pluronicF127 gel on the adventitia.

　　Key words:Yiqihuoxue Prescription;vein graft;vascular restenosis;proliferating cell nuclear antigen;flow cytometer;rabbits

　　血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、迁移导致内膜增厚是冠状动脉旁路移植术后静脉移植物(VG)再狭窄的主要病理特征。益气活血方(Yiqihuoxue Prescription)在心血管系统有多种药理作用，最近实验研究表明益气活血方能干预血管再狭窄病理过程中的多个环节。本实验建立家兔颈总动脉自体颈外静脉移植模型,在VG外膜涂抹由pluronicF127 gel携带的益气活血方剂，观察其对血管再狭窄的影响并讨论其可能机制,为临床应用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　普通级雄性家兔45只(东南大学医学院实验动物中心提供)，体重1.8～3.4 kg，随机分为：(1)A组，手术组;(2)B组，手术+抹胶(pluronicF127 gel)组;(3)C组，手术+抹益气活血方剂(由黄芪、川穹、三七组成)组，益气活血方由pluronicF127gel携带，涂抹于VG外膜。各组均随机分为7、14、28 d 3个亚组，每个亚组5只家兔。

　　1.2 试剂应用

　　PluronicF127 gel购自Sigma公司，增殖细胞核抗原(PCNA)以及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，Masson染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。中药制备：益气活血方由黄芪25 g、川芎15 g、三七5 g配伍组成。药物制备：三七粉碎过百目筛研成末，川芎采用水蒸汽蒸馏法提取挥发油，提药后药渣和黄芪一起加适量水煎煮2次，药液合并浓缩至一定浓度，加入三七粉、川芎挥发油混匀，高温消毒，制成浓度为0.9 g•ml-1的方药。药物购买及煎煮均由东南大学附属中大医院药剂科完成。称取pluronicF127gel粉末0.2 g，加入灭菌的PBS 1 ml(0.01 mol•L-1，pH 7.6)中，充分搅拌，即制成pluronicF127 gel凝胶;如需加入益气活血方则提取1 ml方药,加入pluronicF127 gel凝胶，充分搅拌，即成益气活血方和pluronicF127 gel的混合物。

　　1.3 模型建立

　　家兔以3%戊巴比妥钠30 mg•kg-1耳缘静脉注射麻醉，固定、消毒，颈部正中切口，游离并剪取右侧颈外静脉2.0～3.0 cm，用含0.30 g•L-1罂粟碱及0.15 g•L-1肝素钠的生理盐水浸泡;显露同侧颈总动脉，无创血管夹夹闭其两端，剪断颈总动脉，倒置静脉段，用70 Prolene线行静动脉的端端间断缝合，确定VG血流通畅及术野无出血后，A组家兔逐层缝合关闭切口，B组家兔VG外膜单纯涂抹配制好的pluronicF127gel后逐层缝合关闭切口，C组家兔涂抹配制好的益气活血方和pluronicF127 gel混合物后逐层缝合关闭切口。术后送饲养室喂养，连续3 d肌肉注射青霉素8×105 U。

　　1.4 标本分析

　　术后7、14、28 d取材。采用原位血管固定以确保血管形态在取材和病理标本制作过程中的一致，以利于形态学分析。获取移植静脉段，4%中性甲醛固定，每段血管三等分横断，石蜡包埋，连续切片。HE、Masson染色后测量移植静脉内膜厚度(I)、中膜厚度(M)以及内膜厚度/中膜厚度(I/M)值，每个标本取6个不同400倍光镜视野，计算其平均值;VSMC增殖率=PCNA阳性着色细胞数/总细胞数，通过免疫组化方法检测PCNA，每个标本取6个400倍光镜视野，分别记数每个视野中的阳性细胞数和总细胞数的比值，计算其平均值。取移植血管，去除血管外膜，剪碎血管组织，制备组织匀浆及细胞悬液，按实验动物的分组，以流式细胞仪自动计数10 000个细胞，以细胞周期中各期细胞DNA含量多少及所占总体细胞比例计算结果。

　　1.5 统计学处理

　　数据以x-±s表示，采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 HE和Masson染色结果

　　HE和Masson染色可见，术后14 d各组移植静脉内膜、中膜均不同程度的增厚，但C组移植静脉内膜、中膜厚度及I/M值均明显低于A组和B组(P<0.05)，见表1。表1 术后14 d各组移植静脉内膜、中膜厚度及I/M值与A组比较，*P<0.05，△P>0.05;与B组比较，#P<0.05

　　2.2 免疫组化检测PCNA

　　术后7、14、28 d，各组移植静脉内膜、中膜均出现数量不等的PCNA阳性VSMC，但C组的PCNA阳性VSMC数明显低于A组和B组。各组移植静脉VSMC增殖率结果见表2。表2 术后各组移植静脉VSMC增殖率与A组比较，*P<0.05，△P>0.05;与B组比较，#P<0.05

　　2.3 流式细胞仪DNA含量检测结果

　　术后14 d C组G0/G1、S、G2/M期细胞所占比例逐渐减少，而A组和B组G0/G1、S、G2/M期细胞所占比例逐渐增多，与C组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。表3 术后14 d各组移植静脉细胞各期所占百分比与A组比较，*P<0.05，△P>0.05;与B组比较，#P<0.05

　　3 讨 论

　　冠心病是危害人类健康的常见心血管疾病。目前临床治疗手段很多，冠状动脉旁路移植术仍然是治疗冠心病的主要方法。大隐静脉因具有取材方便、量多、长度可以抵达乳内动脉无法到达的远端分支等优点，成为冠状动脉旁路移植术中使用最多的移植血管。然而术后相当一部分患者出现静脉血管桥再狭窄,大大降低了手术的成功率。据文献报道，乳内动脉桥的10年通畅率为85%～95%，而大隐静脉桥血管(SVG)的10年通畅率仅约40%，未闭塞的SVG中又有40%存在不同程度的狭窄性病变[1]。血管再狭窄的主要病理特征为内膜显著增厚[2]。大量实验研究表明，中膜VSMC在血管再狭窄发生过程中起着重要作用[3]。再狭窄的主要原因是血管内膜损伤后导致细胞增殖、凋亡、迁移及细胞外基质降解和合成，此过程与血管活性物质、细胞生长因子等因素的刺激有关。移植血管再狭窄实际上是血管壁调控失衡的自我修复过程[4]。

　　目前探索再狭窄治疗的药物较多，由于全身治疗不能成功地抑制再狭窄,有学者提出了局部给药的方法。血管局部用药可减少全身血药浓度,克服全身副作用,故局部用药防治血管再狭窄成为研究的热点。常用方法包括经导管局部灌注、球囊导管涂抹、支架携带等。由于受到血流冲刷的影响,局部灌注和球囊导管涂抹法难以使药物在血管内膜长期停留,效果并不理想。支架携带药物可利用多聚体复合物保证药物较长期地停留在血管壁上。临床取得显著疗效的有雷帕霉素涂层支架、紫杉醇涂层支架等。但涂层支架的制作技术要求高、成本高,常规用于实验研究尚不实际[5]。本实验采取了血管外膜涂抹药物的方法,在制作动物模型的同时完成药物的局部应用,不增加手术难度,不影响模型质量,既经济又方便,可以作为一种常用的实验手段。

　　中医认为再狭窄的病因病理是：血管内膜损伤，瘀血阻滞，血脉不通，心脉痹阻，属于瘀血证的范畴，瘀血证的轻重程度是术后再狭窄发生与否的重要影响因素。应用活血化瘀方药能起到改善血瘀状态、预防血管再狭窄的作用[6]。研究表明，中医药是通过抗血栓形成、抑制内皮细胞损伤后的炎症反应、抑制VSMC增生和血管重塑、促进VSMC凋亡及纠正血脂紊乱等几个方面防治血管再狭窄。中医认为再狭窄的基本病理变化属于瘀血证范畴，基本机制是本虚标实。本虚是以脏气亏虚为主，标实以血瘀多见，故治疗宜益气活血为主。在中医气血理论指导下，我们筛选方药，选择具有益气行气、活血化瘀的三味药即三七、黄芪、川芎组成复方制剂[7]。

　　本实验模仿了大隐静脉冠状动脉旁路移植术，术中在家兔的移植静脉外膜涂抹由pluronicF127 gel所携带的益气活血方混合物。PluronicF127 gel最早用做基因载体，其微观结构是密布小孔的网状结构，其生物学性质稳定，组织相容性好，在0～4 ℃环境下呈液态，具有水溶性，可溶入药物，37 ℃时与组织接触立刻变成固态胶体[8]。本实验利用此特点，用其作为缓释载体，在呈液态时溶入益气活血方，配成具有一定浓度的益气活血方液性胶体。术后14 d,C组与A组相比,移植静脉内膜和中膜厚度明显减少,同时I/M值也显著降低。I/M值减少得越多,说明抑制血管内膜增生越明显。而B组与A组相比差异无统计学意义,说明外膜单纯涂抹pluronicF127 gel对移植血管的内膜增生无明显作用。组织学上内膜增生表现为PCNA阳性细胞数增加。PCNA是一种核蛋白,其表达标志了细胞进入S期,故PCNA的存在是细胞增殖的特异性标志[9]。术后7、14、28 d，C组与A组相比,移植静脉壁VSMC增殖率明显降低。同样在同一时间点,B组与A组相比,移植静脉壁中VSMC增殖率无明显差别(P>0.05)，说明外膜单纯涂抹pluronicF127 gel对移植血管VSMC增殖无明显抑制作用。流式细胞仪的细胞周期分析结果显示，益气活血方对增殖VSMC的作用主要是抑制S期和G2/M期百分率、提高G0/G1期百分率，即诱导G0/G1期静止。术后14 d C组移植静脉细胞周期由G0/G1期到S期和G2/M期比例逐渐减少，这说明益气活血方作用于增殖的VSMC后，使得细胞周期主要停滞在G0/G1期，使G0/G1期百分率增加，而S期和G2/M期百分率减少。

　　从本实验可以看出，益气活血方对冠状动脉旁路移植术后所导致的移植静脉狭窄有很好的干预作用，其机制可能在于益气活血方不仅能有效保护血管内皮细胞，促进其损伤迅速修复，还能显著抑制VSMC的过度增殖迁移，减轻移植静脉内膜和中膜增生,减少细胞外基质的大量合成，对抗血管重构。

　　【参考文献】

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