重症肌无力胸腺中CD4+CD25+Treg细胞分布与数量变化的临床意义

　　作者：邹志强,马铮,蒋耀光,王如文,赵云平　　作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军胸外科中心,重庆400042

　　提　要:目的　探讨重症肌无力(myasthenia gravis, MG)患者胸腺内CD4+CD25+天然调节性T细胞(nTreg)的分布和数量变化及其临床意义。方法　采用免疫组化染色观察50例MG胸腺和20例正常胸腺CD25的表达,同时采用流式细胞技术检测10例MG患者胸腺与外周血中CD4+CD25+T细胞在CD4+T细胞中的比例。结果　MG增生胸腺中CD25表达与对照胸腺相比显著升高(P<0. 05),与MGFA分期呈正相关。增生胸腺中CD4+CD25+细胞占CD4+细胞比例明显高于对照胸腺(P<0. 05),而外周血中CD4+CD25+T细胞比例无显著变化(P>0. 05)。结论　胸腺内nTreg细胞数量的下降与MG自身耐受的破坏有重要的关系,进一步研究胸腺内nTreg细胞数量和功能的变化有助于了解MG的发病机制。

　　关键词:重症肌无力;CD4+CD25+调节性T细胞;免疫组化染色;流式细胞技术

　　中图法分类号:R322. 53;R392. 1;R746. 102　　　文献标识码:A

　　Study of intrathym ic CD4+CD25+regulatory T cells in myasthenia gravis patientsZOU Zhi-qiang,MA Zheng,JIANGYao-guang,WANGRu-wen,ZHAOYun-ping,GONGTai-qian(Thoracic and Cardio-vascularSurgeryResearch Center,Institute fSurgeryesearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing 400042,China)

　　Abstract:Objective　To investigate the frequency of intrathymicCD4+CD25+regulatoryT cells(nTreg)and its clinical significance in myasthenia gravis(MG)patients.Methods　The intrathymic expression ofCD25 in 50MG patients and 20 normal thymus tissues as controlswere analysed by immunohistochemicalmethod and the frequency ofCD4+CD25+T cells derived fromMG thymus and peripheralbloodmonocyteswere de-tected in 10MG patients by flow cytometry.Results　The expression ofCD25 in the hyperplastic thymuswasmuch higher(P<0. 05)than that in the control,and correlated withMGFA classification. The percentage ofCD4+CD25+T cells inMG hyperplastic thymuswashigher than that in control(P<0. 05),while the percentage in the peripheralblood monocyteswas of no significant difference with the contro.lConclusion　The in-creased frequency of intrathymic CD4+CD25+regulatoryT cells has an important relationshipwith the destruc-tion of self-tolerance inmyasthenia gravis patients. Further investigation on the changes of frequency and func-tion of the intrathymic nTreg cellswould conduce to understand themechanism ofMG.

　　Key words:myasthenia gravis;regulatoryT cell;immunohistochemical staining;flow cytometry

　　重症肌无力(myasthenia gravis, MG)是一种T细胞辅助、抗体介导并补体参与的以神经肌肉接头传递障碍为特征的自身免疫性疾病,目前有关其免疫耐受破坏的机制还不清楚。动物实验表明来源于胸腺的CD4+CD25+调节性T细胞,即天然调节T淋巴细胞(natural regulatoryT cel,l nTreg),可以主动抑制自身反应性T细胞的活化和增殖,维持外周免疫耐受稳态,从而避免自身免疫性疾病的发生[1]。本研究采用免疫组化染色和流式细胞仪检测方法,分析MG胸腺组织中nTreg细胞标记物CD25的表达,探讨其在人类MG发病中的作用。

　　1　材料与方法

　　1. 1　标本与分组

　　收集本科2003年1月至2006年4月手术切除的MG胸腺共50例用于免疫组织化学检测。男性22例,女性28例;年龄9~74(26. 66±16. 29)岁;MGFA临床分型:Ⅰ型22例,Ⅱa型10例,Ⅱb型11例,Ⅲ型7例(Ⅲa型3例,Ⅲb型4例)。将胸腺标本按常规病理分组:增生胸腺组(hyperplastic thymus, HT)37例、萎缩胸腺组(atrophic thymus, AT)6例、胸腺瘤组( thy-moma, Tm)7例。

　　对照胸腺组织(control group, CG),取自本院心外科手术为暴露心包而切除的胸腺组织(排除急性感染患者),共20例,年龄3~45(25. 37±12. 32)岁;男性9例,女性11例;临床诊断先天性心脏病房间隔缺损7例,室间隔缺损6例,风湿性心瓣膜病7例。两组性别、年龄比较无显著性差异(P>0•05)。

　　流式细胞分析所用胸腺标本取自我科2006年1-11月MG患者胸腺切除组织,共10例。其中男性6例,女性4例;年龄10~38(30. 71±12. 92)岁;MGFA分型:Ⅰ型3例,Ⅱa型4例,Ⅱb型2例,Ⅲa型1例;病理检查均为胸腺增生。同时在术前抽取患者静脉血作外周血分析。正常对照标本同上。

　　1. 2　免疫组织化学观察MG胸腺CD25的表达

　　免疫组化染色操作按试剂盒(S-P法北京中杉公司提供)说明书,简述如下。CD25使用即用型单核隆抗体(eBioscience公司):采用柠檬酸修复液,微波炉加热。使用DAB一步法显色剂显色。阳性判断: CD25为细胞膜显棕色、棕褐色为阳性表达。结果分析:选择阳性表达较为集中区域(胸腺瘤直接选择瘤组织),在高倍视野下计数,“-”表示阴性(阳性细胞数<20% );“+”表示阳性(20%≤阳性细胞数<50% );“++”表示强阳性(阳性细胞数≥50% )。

　　1. 3　流式细胞检测CD4+CD25+T淋巴细胞

　　采用Follicol法制备胸腺单核细胞悬液,并作部分改进。将术中切取的胸腺置剪碎,经100目不锈钢滤网,用玻璃注射器芯研磨过筛;再300目过滤;缓慢加入盛有淋巴细胞分离液的离心管,离心后小心吸出中间层呈白色膜状的单个核细胞层,加适量PBS液洗涤,离心。在显微镜下计数,调细胞浓度为(1~4)×106/m,l台盼蓝计数活细胞>95%。

　　同样采用Follicol法制备外周血单核细胞悬液(参照说明书)。PBS重悬细胞后分装试管,每管100μ;l然后分别加入FITC-CD4、PE-CD25、PE-cy5-CD8荧光标记的单隆抗体10μl(eBioscience, USA),另以未加抗体作阴性对照、荧光标记的同型抗体作同型对照。避光孵育30 min,加适量PBS液洗涤2次,悬浮细胞至200μ,l上机检测。参照仪器操作说明调节参数。

　　1. 4　统计学方法

　　采用SPSS 10. 0统计软件对计数资料行χ2检验,计量资料行t检验。

　　2　结果

　　2. 1　MG胸腺CD25表达

　　CD25+细胞在MG增生胸腺与对照胸腺组织中分布相似,主要分布于胸腺髓质和小梁间隔区,皮质中也有少量分布,但在MG增生胸腺中可见CD25+细胞围绕在生发中心的周围,淋巴滤泡和胸腺小体(Hassall’s Body)内亦偶有分布(图1A、B)。MG增生胸腺中CD25阳性表达较对照显著增高(图1A,表1);萎缩胸腺组织中CD25表达与对照胸腺无显著差异(P>0•05);胸腺瘤组织仅有少量CD25阳性表达(表1)。A:增生胸腺,CD25阳性细胞主要位于胸腺髓质　(S-P×100)B:CD25阳性细胞围绕生发中心　(S-P×200)图1　胸腺CD25表达　(棕色颗粒为阳性着色)

　　2. 2　MG胸腺CD25表达的临床意义

　　MG患者胸腺内CD25的表达与性别、年龄差异无统计学意义(P>0•05),但与MGFA临床分型有关, CD25表达在各MGFA分型间差异显著(χ2=10•27,P<0•01), CD25阳性表达随分级的增加而升高(表1)。表1　胸腺组织中CD25表达及其临床意义

　　CD25

　　项目　　例数

　　- + ++

　　病理类型

　　CG 20 2 15 3

　　HT 37a1 15 21

　　AT 6 0 2 4

　　Tm 7bc7 0 0

　　性别

　　男22 1 7 14

　　女28 1 10 17

　　年龄(岁)

　　<40 40 2 13 25

　　≥40 10 0 4 6

　　MGFA

　　Ⅰ22 2 11 9

　　Ⅱ21 0 6 15

　　Ⅲ7 0 0 7

　　a:P<0. 05,b:P<0. 01,与CG组比较;c:P<0. 05,与HT组比较

　　2. 3　MG胸腺、外周血CD4+CD25+T细胞比率

　　免疫组织化学检测结果显示,胸腺瘤内仅少量CD25+细胞表达,因此流式细胞检测中排除了胸腺瘤病例。MG增生胸腺组织中,CD4+CD25+细胞占CD4+T淋巴细胞的比率高于对照胸腺组织(P<0•05);而在外周血, CD4+CD25+T细胞比率无显著性差异(P>0•05)(表2)。表2　胸腺及外周血CD4+CD25+T细胞比率胸腺外周血

　　组别

　　CD4+CD25-CD4+CD25+CD4+CD25-CD4+CD25+

　　对照组94. 78±18. 21 5. 22±1. 39 90. 14±14. 33 9. 86±3. 29

　　MG组93. 83±17. 57 7. 17±2. 22a89. 69±20. 87 10. 31±5. 53

　　a:t=2. 18,P=0. 032,与对照组比较

　　3　讨论

　　研究表明,来源于胸腺的nTreg细胞与小鼠自身免疫性胃炎、肠炎以及1型糖尿病等自身免疫性疾病的发生密切相关[2]。在人类的多种自身免疫性疾病

　　如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮及多发性硬化症等中,亦发现nTreg细胞的异常[3]。重症肌无力是一种T细胞辅助、抗体介导的以神经肌肉接头传递障碍为特征的自身免疫性疾病,但nTreg细胞在MG发病中的作用尚不清楚。多数MG患者胸腺内有淋巴滤泡增生等病理性改变[4],并可在胸腺内发现活化的AchR特异性自身反应性T细胞和产生抗-AchR抗体的B淋巴细胞[5, 6],提示异常增生的胸腺组织可能就是MG自身免疫反应发生和维持的中心。研究表明,nTreg细胞不仅可以在靶器官引流淋巴结中抑制自身免疫性T细胞的激活和细胞因子的释放,而且当自身免疫性细胞进入靶组织并造成组织炎症和破坏时, nT-reg细胞可以进一步激活并迁移到炎症部位,在局部抑制自身免疫性T细胞的活性[7]。因此,推测作为MG反应中心的胸腺组织可能是nTreg细胞发挥免疫调节作用的主要场所,对胸腺组织中nTreg细胞进行研究可能有助于了解MG免疫耐受破坏的机制。

　　本实验显示, CD25+细胞主要分布于胸腺髓质及小梁间隔,少量见于胸腺皮质,与Balandina等[8]的报道相一致,并可见MG胸腺CD25+细胞散在分布于淋巴滤泡内以及生发中心周围。与对照胸腺组织比较,MG增生胸腺以及瘤旁胸腺组织中CD25表达显著升高,而萎缩胸腺CD25表达则无变化,胸腺瘤中仅有少量表达。流式细胞计数结果也显示增生胸腺组织中CD4+CD25+细胞占CD4+细胞比例显著高于对照胸腺组织,与文献[9]报道一致;而在外周血中,MG患者CD4+CD25+T细胞与对照相比,无显著性差异。由于CD25不仅可以高水平持续表达于nTreg细胞,还可表达于活化的效应性T细胞[10],因此,我们推测MG胸腺组织中CD4+CD25+T细胞比例显著升高的原因可能与增生胸腺内效应性T淋巴细胞大量激活有关。

　　总之,本研究结果表明,MG胸腺内nTreg细胞数量的下降与自身反应性T细胞的大量激活以及MG自身耐受的破坏和有重要的关系,进一步研究胸腺内nTreg细胞数量和功能的变化有助于了解MG的发病机制。

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