免疫组化联合抗体在胸水析出物诊断中的应用

　　作者：邢荣格,张晓玲,高远　　作者单位：河北省沧州市中心医院病理科

　　【摘要】目的通过对胸水离心析出物进行石蜡包埋，探讨免疫组化联合抗体在肿瘤细胞学诊断中的应用价值。方法　对86例胸水析出物进行石蜡包埋切片，并应用免疫组织化学SP法检测角蛋白(CK5/6、CK8/18)、癌胚抗原(CEA)、波形蛋白(Vim) 、间皮细胞(MC)、钙结合蛋白(Cal)和甲状腺转录因子1(TTF-1)的表达并进行统计学分析。结果　对胸水析出物进行石蜡包埋切片，联合应用CK5/6、CK8/18、CEA、Vim 、MC 、Cal和TTF-1七种抗体检测，肿瘤细胞的阳性率与常规细胞学涂片的阳性率之间存在明显的差异(P<0.05)，对组织学已经证实的86例恶性肿瘤所致的胸水析出物连续切片，80例为阳性，而在常规涂片中阳性率仅为47例，差异有统计学意义(P<0.05)。结论　胸水析出物石蜡包埋切片联合应用免疫组织化学染色，能够明显增加阳性细胞的检出率，具有很高的应用价值。

　　【关键词】 胸水;细胞学;抗体;石蜡包埋;免疫组织化学

　　胸水的脱落细胞学检查是病理科的常规检查，目前大多数基层医院病理科仍采用胸水离心后直接涂片法检查肿瘤细胞，由于各种原因，阳性细胞检出率较低。近几年我们科将离心后的沉淀物收集处理，制成石蜡切片，并应用免疫组织化学染色，能够明显提高胸水内阳性细胞的检出率，具有很高的应用价值，报告如下。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料

　　收集我院2010年1月至2010年12月临床各科室送检的胸水标本326例，常规做细胞学涂片，对组织学已经证实的、析出物较多的86例做石蜡包埋连续切片对比检查，其中男55例，女31例;年龄40～90岁，平均年龄56岁。所有石蜡包埋块做角蛋白(CK5/6、CK8/18)、 癌胚抗原(CEA)、波形蛋白(Vim)、间皮细胞C(MC)、钙结合蛋白C(Cal)和甲状腺转录因子1(TTF-1)七种免疫组织化学染色。

　　1.2　方法

　　选取临床送检的新鲜胸水(放置时间<2 h)，置于2个50 ml离心试管内，每管50 ml,2 000 r/min，离心15 min，弃去上清液，吸出沉淀物制成常规涂片4张，剩余沉淀物中加入10%中性甲醛50 ml固定12 h，收集所有固体物用包埋滤纸包裹，放入脱水盒中并单独编号，然后与组织标本一同放入脱水机中，固定、脱水、透明、浸蜡程序同组织标本，最后制成石蜡组织块。免疫组化S-P即用型试剂盒及即用型CK5/6、CK8/18、CEA、Vim、MC、Cal、TTF-1鼠抗人单克隆抗体均购自北京中杉生物技术公司。所有标本均在同一条件下采用SP法进行免疫组化染色。切片厚度4 μm，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。免疫组化染色结果判定 CK5/6、CK8/18、CEA、Vim、Cal，肿瘤细胞胞质着色为阳性;MC肿瘤细胞胞膜着色为阳性;TTF-1细胞核着色为阳性， 阳性细胞数<10%为阴性，≥10%为阳性[1]。

　　1.3　主要试剂

　　免疫组化所用抗体来源见表1。表1　免疫组化所用抗体来源

　　1.4　统计学分析

　　计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　阳性细胞检出情况

　　在86例胸水病例中，析出物石蜡包埋切片肿瘤细胞阳性者80例，常规涂片阳性者47例，常规涂片阳性者石蜡包埋切片中全部阳性。石蜡包埋切片阳性率明显高于常规涂片，两者差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2　免疫组化结果

　　80例石蜡包埋切片阳性标本，全部进行CK5/6、CK8/18、 CEA、 Vim 、MC、 Cal和TTF-1免疫组织化学染色，其中CK5/6阳性33例，CK8/18阳性44例， CEA阳性49例，Vim阳性23例，MC阳性21例， Cal阳性23例，TTF-1阳性3例。结合细胞学形态和临床情况，病理诊断鳞癌10例，腺癌44例，未分化癌3例，间皮瘤20例。3例由于间皮增生和间皮瘤鉴别困难，细胞学无法明确诊断，后经组织学证实间皮增生2例，间皮瘤1例。

　　2.3　细胞学形态

　　胸水内细胞成分复杂，检出的肿瘤种类较多，常见的有腺癌、鳞癌、间皮瘤、未分化癌等。大多数细胞呈圆形、卵圆形、片状、团状分布。腺癌细胞由于胞质内富含粘液，可见黏液空泡，常排列成腺泡状或腺管状，核大深染不规则，染色质粗，核仁较大。鳞癌细胞单个或成堆出现，癌细胞形态主要为圆形、卵圆形，核大，核仁清楚。间皮细胞多单个或片状分布，细胞圆形、卵圆形，核膜光滑，异型性小，有时也形成假腺样或乳头状结构，与腺癌不易鉴别，鉴别诊断主要依靠免疫组化。未分化癌细胞小，圆形、类圆形或瓜子形，胞质极少，核染色深，癌细胞排列紧密而不重叠。胸水内肿瘤细胞由于缺少组织学结构，各类型之间常缺乏明显特征，免疫组化是鉴别诊断的主要手段。

　　3　讨论

　　胸水脱落细胞学检查是临床病理检查最常用的方法，常规使用的离心涂片法，阳性细胞的检出率较低，主要原因是：(1)常规涂片法中所收集的细胞数量少，标本中大量细胞随残液弃去。(2)制出的涂片厚薄不均，细胞重叠堆积，常常造成诊断困难而出现假阴性。(3)常规涂片中高分化腺癌细胞与间皮细胞鉴别困难，又无法进行免疫组织化学染色，不能做出肯定的诊断。为解决这一问题，已有文献介绍了不同的方法，其目的都是收集送检标本中的全部细胞，通过不同的方法做成细胞蜡块，这样制出的切片细胞数量多，细胞结构完整，图象背景清晰，厚薄均匀，可以大大提高阳性细胞的检出率[2]。另外石蜡切片可进行免疫组织化学染色，应用联合抗体检测[3]，可对肿瘤细胞进行分类，即可反复、间断切片，又可长期保存，所需设备简单，操作易行，值得大力提倡和推广。

　　胸水中最难鉴别的是分化好的腺癌细胞与增生间皮/间皮瘤细胞。免疫组织化学技术是鉴别诊断的惟一方法。在临床实践过程中，由于单个抗体对不同肿瘤的特异性和敏感性不同，常采用多种抗体联合检测。有学者将Cal、CEA、CK和Vim四种特异性的抗体应用于胸腹水细胞学涂片，发现它们可以在癌细胞、恶性间皮瘤及增生性间皮细胞的鉴别中起重要作用[4] 。Cal是一种钙结合蛋白，存在于神经元及其他细胞中，间皮瘤中亦有表达，而腺癌极少表达，它是鉴别恶性间皮瘤最特异性的标记物[5]。MC主要分布于间皮细胞中，腺上皮一般不表达。CK5/6为高分子量的细胞角蛋白(58 kDa和56 kDa)，在正常组织中，表达在皮肤的基底细胞和棘层细胞，部分前列腺基底细胞 ，导管上皮的基底细胞以及部分的鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞和间皮细胞，腺上皮细胞阴性表达。因此，可用于鳞癌和腺癌，间皮瘤和腺癌的鉴别诊断。CEA 胚胎时期含量较高，在成人结肠的正常黏膜上皮和其他组织中也有极低的表达。肿瘤组织分化越低则CEA含量越高[6]。CEA广泛存在于各种腺上皮源性肿瘤中，尤其是各种腺癌细胞中，胃肠道腺癌的阳性率较高，乳腺癌、肺癌和卵巢癌也可有不同程度的表达，而体腔间皮细胞不含CEA，在间皮瘤和增生性间皮细胞中不表达或低表达。因而CEA是鉴别腺癌和间皮瘤的重要标记物。Vim是间叶源性肿瘤标志物，绝大多数癌细胞为阴性表达，恶性间皮瘤和反应性增生的间皮细胞中呈阳性表达，有研究报道Vim在间皮瘤的阳性率较高，而在腺癌为阴性[7]。CK8/18 抗体所识别的是分子量分别为52 kDa(CK8)和45 kDa(CK18)的细胞角蛋白，主要标记各种单层腺上皮，鳞状上皮一般不表达此类抗原，因此可作为腺上皮及其来源肿瘤的首选标记物。TTF-1是分子量为38～40 kDa的核蛋白，在胎儿肺组织和成人Ⅱ型肺泡上皮中存在，只表达于肺和甲状腺原发的癌[8]，TTF-1阳性，组织学上排除甲状腺来源即可确定为肺来源的肿瘤。因此CK5/6、CK8/18、 CEA、TTF1一组抗体联用可以鉴别鳞癌与腺癌，并可判断肿瘤细胞来源于肺脏。间皮瘤/间皮增生CK5/6、 Vim、MC、 Cal阳性表达，但良恶性的判断需根据肿瘤细胞的异型性、核分裂数及临床情况综合分析。CK5/6、CK8/18阴性而TTF-1阳性，根据细胞学形态可考虑肺未分化癌的诊断。

　　常规细胞离心涂片法，具有简便、快速、痛苦小的特点，但阳性率低，容易出现假阴性。而离心沉淀物石蜡包埋法弥补了阳性率低的缺点，免疫组化联合抗体的应用又解决了细胞学无法组织学分型的缺点，随着良、恶性胸水鉴别诊断研究的不断深入，除细胞学检查外，DNA含量与染色体分析，端粒酶检测等新的方法，也在不断探索完善中。

　　【参考文献】

　　1　魏长宏，耿爱芹.免疫组织化学在胸膜间皮瘤诊断中的作用.武警医学院学报，2000,9：146-148.

　　2　郭智俊，彭桂香，潘乃梁.胸腹水沉淀物琼脂石蜡双包埋切片法与常规涂片法的对比.临床与实验病理学杂志，2002,18：437.

　　3　丁华新，何向蕾，张培辉.免疫细胞化学在胸腹水细胞学鉴别诊断中的应用.诊断病理学杂志，2002,9：220.

　　4　Tseng CJ，Jain S，Hou HC，et al.Application for the telomerase assay in peritoneal washing fluids.Gynecol Oncol,2001,81：420-423.

　　5　Wieczorek TJ，Krane JF.Diagnostic utility of calretinin immunohisto-chemistry in cytologic cell block preparations.Cancer,2000,90：312-319.

　　6　倪灿荣主编.免疫组织化学实验新技术及应用.第1版.北京：北京科学技术出版社，1993.326.

　　7　Bateman AC，al-Talib RK，Newman T，et al.Immunohistochemi-Cal phenotype of malignant mesothelioma：predictive value of CA125 And HBME -1 expression.Histopathology,1997,30：49-56.

　　8　王红梅，周小鸽.TTF-1在肺癌诊断与鉴别诊断中的应用价值.诊断病理学杂志，2005,12：B441-443.