右归丸对骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期和凋亡的影响

　　作者：郑轶峰,姜建青,张力华,石娅萍,黄茜　　作者单位：成都军区总医院心胸外科，四川 成都 610083;成都中医药大学解剖学与组织胚胎学教研室,四川 成都 610075

　　【摘要】目的 观察右归丸对骨髓抑制小鼠外周血、骨髓细胞周期和凋亡的影响, 探讨其可能造血调控作用机制。方法 用全自动血细胞分析仪、白细胞计数法和流式细胞术(FCM )分别检测右归丸对骨髓抑制小鼠外周血、骨髓有核细胞数以及骨髓细胞周期和调亡的影响。结果 右归丸中、高剂量均能明显升高外周血红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)、骨髓有核细胞(BMC) 数，右归丸高剂量对血小板(PLT)和白细胞(WBC)有明显升高作用。右归丸低、高剂量组均能促进骨髓G0/G1 期细胞向S 期细胞以及S 期细胞向G2/M 期细胞的转化, 从而导致G2/M 期细胞比例明显升高, 增殖指数(PI)也明显升高。中、低剂量组右归丸的骨髓细胞凋亡比例显著下降。结论 右归丸可能通过促进骨髓细胞修复受损的DNA，加速通过G1/ S和S期监测点，进行增殖和分化;抑制造血细胞的凋亡;调节造血细胞增殖与凋亡之间的平衡等机制，从而促进损伤骨髓造血功能恢复。

　　【关键词】 右归丸,骨髓抑制,骨髓细胞 细胞周期 凋亡

　　Abstract Objective To study the effect of You Gui Wan on peripheral blood cells, bone marrow cell cycle and apoptosis of myelosuppressed mice and to discuss its possible mechanism in hematopoietic regulation.Methods Automatic blood cell analysator, white blood cell counting and flow cytometry (FCM) were applied respectively in detecting the effect of You Gui Wan on peripheral blood cells, bone marrow nucleated cells, bone marrow cell cycle and apoptosis of myelosuppressed mice.Results Peripheral red blood cells, hemoglobin and bone marrow nucleated cells increased obviously by middle or high dose You Gui Wan; high dose You Gui Wan had significant effect in raising the level of blood platelet and white blood cells; low or high dose You Gui Wan promoted the transition of bone marrow cells from GO/G1 to S phase and that from S phase to G2/M phase, thus led to a higher cell proportion in G2/M phase as well as the proliferation index; middle or low dose You Gui Wan decreased bone marrow apoptosis greatly. Conclusions You Gui Wan may promote the recovery of hemopoietic function of injured bone marrow cells by repairing the damaged DNA and it can accelerate GO/G-S phase and S-G2/M phase transition, activate the proliferation and differentiation, inhibit the apoptosis of hemopoietic cells and regulate the balance between their proliferation and apoptosis.

　　KEYWORDS You Gui Wan myelosuppression bone marrow cell cell cycle apoptosis

　　骨髓抑制是肿瘤病人放、化疗的主要并发症之一，其所致白细胞减少诱发的感染和血小板减少引起的出血，严重影响病人的治疗和预后[1]。主要表现为神疲乏力、腰膝酸软、食欲减退、面色无华、心悸耳鸣等非特异性症状，属于中医的“虚劳”范畴 。近年来，有学者应用补肾培元、温补肾阳来辩证治疗放、化疗所致的白细胞减少症，疗效确切[2，3]。右归丸出自明代温补名家张景岳的《景岳全书》, 由熟地、制附子、肉桂、山药、山茱萸、菟丝子、枸杞、鹿角胶、杜仲、当归等药组成, 为补阳的代表方剂，具温补肾阳、填精益髓之功效。本研究采用60Co伽马射线和环磷酰胺(CTX)联合制作骨髓抑制小鼠模型，通过全自动血细胞分析仪、白细胞计数法、流式细胞术分别观察了右归丸对骨髓抑制小鼠外周血细胞、骨髓有核细胞数、骨髓细胞周期及细胞凋亡的影响，为其在临床上的进一步应用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 8～12 周龄BALB/c 纯系雄性小鼠48 只，体质量18～22 g，由四川大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：川实动管字09号;右归丸，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂产品(产品批号8013042)，使用前用生理盐水配制成相应浓度的溶液;环磷酰胺，山西普德药业有限公司产品(产品批号20080106);重组人粒细胞集落刺激因子注射液(特尔津)，厦门特宝生物工程股份有限公司产品(产品批号200807B20);碘化丙啶(P I) 荧光染液(美国Sigma 公司产品) ;60Co γ射线放射源(四川省肿瘤医院放疗科提供);全自动血细胞分析仪BC-3000 Plus型(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司);流式细胞仪(EPICS XL型, Beckman-Coulter 公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 骨髓抑制动物模型的制备 参照严苏纯等(4)的方法造模。小鼠经2.0 Gy 60Co 照射后的第4d 开始，每天腹腔注射环磷酰胺(CTX) 50 mg/kg (于临用前配制)，连续给药3 d 完成模型制备。

　　1.2.2 动物分组与给药 将小鼠随机分为正常对照组、模型组、右归丸低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组，每组8 只。除正常对照组外, 其它5组均进行造模。小鼠造模完成的第2 d 开始给药, 正常对照组和模型组每只灌胃0. 2 ml/ 10 g/d 的生理盐水;低剂量、中剂量和高剂量右归丸组分别给右归丸2.25 g / k g 、4.5 g / kg和9.0 g / kg, 每只小鼠灌胃0. 2 ml/ 10 g /d, 阳性对照组每日腹腔注射重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)150ug/kg，共给药7 d。

　　1.2.3 外周血细胞计数 最后一次给药后24 h，经小鼠眼球后静脉丛采血0.1 ml，用BC-3000 Plus 型全自动血细胞分析仪进行血常规检测。

　　1.2.4 骨髓有核细胞悬液的制备 最后一次给药后24 h, 以颈椎脱臼法处死各组小鼠, 取出股骨, 剔除肌肉和结缔组织, 剪开股骨两端, 用6 号针头以生理盐水液冲出骨髓细胞, 再用4 号针头过滤制成单个骨髓细胞悬液。取部分骨髓细胞悬液在显微镜下按白细胞计数法进行骨髓有核细胞计数。

　　1.2.5 细胞周期样品制备 将上述单个骨髓细胞悬液离心(1000 r/m in, 5 m in)，弃上清，用PBS 洗涤两次，去上清液，滴入70% 冷乙醇固定细胞， 立即混匀，用封口膜封口，放置4 ℃冰箱冷藏备用。

　　1.2.6 细胞周期分析 和凋亡细胞测定　取上述70% 冷乙醇固定的细胞样品, 用PBS 洗两次, 以洗去残留的乙醇, 加100 μl PBS 后混匀, 加碘化丙锭染液1ml染色30分钟(4℃, 避光30min),上流式细胞仪检测细胞周期的变化和凋亡细胞的比例。结果以细胞周期各时相细胞百分率表示，并按公式: PI= (S+G2/M )/(G0/G1+S+G2/M)×100% 计算细胞增殖指数(proliferation index, PI)。

　　1.3 统计学方法 实验所得数据用表示，各组数据先行方差齐性检验，再进行单因素方差分析，α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 右归丸对骨髓抑制小鼠外周血及骨髓有核细胞的影响 由表1 可见：与正常组相比，模型组白细胞、红细胞、血红蛋白 、血小板、骨髓有核细胞均明显降低( P <0.01)。与模型组相比教，右归丸中、高剂量的红细胞、血红蛋白 、骨髓有核细胞明显高于模型组( P <0.05)，右归丸高剂量组的白细胞和血小板明显高于模型组( P <0.05)。和阳性组相比，右归丸各剂量组的白细胞和骨髓有核细胞均低于阳性组( P <0.01)，红细胞、血红蛋白 、血小板与阳性组相比无统计学差异( P > 0. 05);高剂量组右归丸骨髓有核细胞计数明显高于低剂量组( P <0.05)。

　　表1 右归丸对骨髓抑制小鼠外周血及骨髓有核细胞的影响(略)

　　注:与正常组比较:△P<0.05,▲P<0.01;与模型组比较：☆P<0.05,★P<0.01;与阳性组比较:■P<0.01;同低剂量组比较：◇P<0.05

　　2.2 右归丸对骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期和调亡的影响 由表2可见，与模型组相比，其余各组G0/G1期细胞比例均有不同程度降低，除中剂量组外，均有明显差异(P<0.05)。各组S期细胞比例高于正常组，除了模型组和中剂量组外，其余各组均有统计学差异;除了右归丸中剂量组外，各药物组S期细胞比例高于模型组(P<0.01)。各组G2/M期细胞比例均低于正常组(P<0.01)，各药物组G2/M期细胞比例均高于模型组(P<0.01)。除中剂量组外，各药物组增殖指数与模型组比较均有所提高，且有统计学意义。和正常组相比，各组凋亡细胞比例明显升高(P<0.01);和模型组相比，各药物组凋亡细胞比例均降低，除了高剂量组外，均有统计学意义。

　　表2 右归丸对骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期和调亡的影响(略)

　　注:与正常组比较:△P<0.05,▲P<0.01;与模型组比较：☆P<0.05,★P<0.01;与阳性组比较:□P<0.05，■P<0.01. 同中剂量组比较：◇P<0.05，◆P<0.01

　　3 讨论

　　目前, 对恶性肿瘤患者放化疗所致骨髓抑制所引起的白细胞减少症，临床多用重组粒细胞集落刺激因子(GCSF)来治疗，虽然疗效确切，但作用时间短且价格昂贵，亦且有发热、骨痛等副反应，有报道指出，部分实体肿瘤细胞能够分泌 CSFs和/或表达相应受体[5]，外源性 GCSF也许会增加 CSFs受体阳性肿瘤的转移率和局部复发率[6]，从而对GCSF应用的安全性提出置疑。因此需要在丰富的中医药宝库中寻找有效、价廉和安全的替代和/或补充药物，并且探讨其机理。本试验根据中医理论结合现代研究手段，初步探讨右归丸对放化疗小鼠骨髓造血功能的影响。

　　和正常组相比，模型组小鼠外周血和骨髓有核细胞数均明显降低，说明模型成功。和模型组相比较，右归丸对外周血白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板均有影响，用药7 天后，其骨髓细胞数明显增加，外周血三系细胞成分都有不同程度地升高，以中、高剂量效果明显，并且有剂量依赖关系。以上结果表明，右归丸可较明显促进放化疗骨髓抑制的小鼠造血细胞功能的恢复。

　　在细胞周期调控中，有两个重要的监测点，分别位于G1与S期和G2与M期之间[7，8]。处于增殖期的骨髓细胞对放化疗损伤最为敏感，研究证实，细胞周期中S 期对放射线敏感性最低，其次是G0/G1期，G2/M 期敏感性最强[9]，放化疗造成造血细胞DNA损伤后，激活细胞周期检测点机制，将细胞周期阻滞于G1期修复损伤DNA，对不能修复者启动凋亡程序消除受损细胞[10]。所以，细胞周期各个时相的分布情况和凋亡细胞的比例能够反映骨髓细胞受损和恢复的程度。本实验采用流式细胞术对骨髓细胞周期进行分析后，发现模型组G0/G1和S 期细胞比例高于正常组，G2/M 期比例和增殖指数明显低于正常组，而调亡比例明显高于正常组，表明放化疗不但造成引起G1 期阻滞，而且造成S期阻滞，并通过促进细胞凋亡而导致骨髓抑制，这和近期的研究结果类似[11]。和模型组相比，右归丸各剂量组G0/G1期比例显著下降， S期细胞比例和G2/M期细胞比例明显增加，增殖指数提高，而凋亡比例下降，表明右归丸可能通过加快损伤DNA修复，解除细胞周期阻滞，使受阻滞的各期细胞加速通过G1/S和S期监测点、还包括G2/M监测点，同时抑制细胞凋亡，来恢复造血细胞的数目。进一步研究各组之间增殖指数和凋亡比例的关系，我们发现，与模型组的低增值指数和高凋亡率以及阳性组的高增值指数和低凋亡率不同，随着右归丸各剂量组之间增值指数的增加，其凋亡细胞的比例也有所增加，这表明右归丸可能通过调节造血细胞增殖与凋亡之间的平衡，来修复放、化疗骨髓抑制小鼠的造血功能。

　　综上所述，本实验提示右归丸以通过促进G0/G1期的造血细胞修复受损的DNA，加速通过G1/S和S期监测点;抑制造血细胞的凋亡;调节造血细胞增殖与凋亡之间的平衡等机制来促进放、化疗骨髓抑制的小鼠造血功能恢复，提高外周血象。

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