干细胞治疗肺动脉高压研究的进展

　　作者：赵科研1，柳克祥2，侯明晓1 作者单位：全军医药卫生科研基金(08G004) 1.中国人民解放军沈阳军区总医院心外科，辽宁 沈阳 110003;2 吉林大学第二医院心外科

　　【摘要】 肺动脉高压是以肺动脉压力和阻力渐进性增高为特征，难以治疗，最终导致患者右心衰竭而死亡。目前有研究认为干细胞移植治疗肺动脉高压的疗效比传统治疗更好。本文从种子细胞、转染基因、移植途径、作用机制及临床应用等方面介绍干细胞治疗肺动脉高压方面的最新进展。

　　【关键词】 高血压,肺性,干细胞移植,模型,动物

　　肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH)是难治性疾病,主要表现为肺动脉压力的上升和肺血管阻力的增加，逐渐出现右心衰竭，甚至死亡。尽管在过去的十年里对PAH的治疗有了明显的进步，但是预后仍然很差。静脉给予药物(如前列腺素I2，内皮素受体拮抗剂)或者吸入一氧化氮(NO)显示可以暂时降低PAH，但这些效果不能持久。近年来，再生手段和基因治疗用于PAH的治疗已有报道[1]。再生健康的内皮细胞，如内皮祖细胞、内皮样祖细胞、骨髓细胞和骨髓间充质干细胞可用于此治疗，转染肾上腺髓质素(Adrenomedulin，AM)或一氧化氮合酶增加内皮细胞分泌[1、2]也得到应用。两种方法已经获得比传统的治疗更好的结果。国内外研究干细胞治疗PAH的文章还不多，但其治疗效果已受到人们的关注，逐渐成为研究的热点，本文对此进行综述。

　　1 肺动脉高压动物模型

　　目前多采用动物模型进行研究。常用慢性低氧、野百合碱(monocrotaline, MCT) 注射、单纯左肺切除(pneumonectomy, PE)，或MCT注射加左肺切除和分流法[腹主动脉- 腔静脉(abdominal aortocaval fistula shunting, A-VF)分流法和大动物手术体肺分流法]等方法建立的动物模型来研究PAH。

　　2 种子细胞

　　成体干细胞与胚胎干细胞移植相比，移植不涉及伦理、法律、政治等社会问题, 又属于自身组织, 没有免疫原性而且易于获得, 因此成为移植治疗的主要细胞来源。

　　2.1 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)

　　MSCs 在骨髓中含量较少, (0.1～1) ×106个骨髓细胞中含有1个MSC。MSCs 具有自我更新和分化的潜能, 为中胚层发育的早期细胞, 可分化为骨、软骨、脂肪、心肌细胞、神经细胞及神经胶质细胞等。MSCs 的鉴定及纯化多利用流式细胞技术或免疫磁珠的方法, 通过测定MSCs表面标志进行, 但由于MSCs分离和培养方法不同, 其表面标志存在很大差异, 常用的阳性表面标志为CD44、CD71、SH2、SH3 等, 阴性表面标志为CD34、CD45及CD14 等。Baber等[3]注射MCT 2周后气管内注射3×106个MSCs减轻了肺动脉压力和肺血管阻力上升，修复了肺血管对乙酰胆碱的反应，同时减少了右心室的肥厚。

　　2.2 内皮祖细胞(endothelium progenitor cells，EPCs)或内皮祖样细胞(endothelium progenitor like cells，ELPCs)

　　内皮细胞功能的恶化可能在PAH病理形成中起到重要作用。因而内皮细胞是治疗PAH的方法之一。Zhao等[1]取骨髓培养内皮细胞样的祖细胞。内皮细胞培养基培养7～10 d后，骨髓来源的单核细胞呈现典型的内皮细胞的铺路石样形态，表达内皮细胞标记物，包括Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil acLDL)，荆豆凝集素(UEA-1)，免疫组化染色血管假性血友病因子(vWF)和胎儿肝激酶(Flk-1)，表达65%～83%。以其治疗MCT损伤的肺，与肺动脉微血管结合，在MCT注射后3 d注入到肺循环可几乎完全阻止PAH。

　　2.3 脐血内皮细胞

　　Nagaya等[4]将人脐带血单核细胞培养在纤维连接蛋白包被的培养皿中，M199培养基，20%胎牛血清，牛脑垂体浸液，血管内皮生长因子，碱性成纤维生长因子，肝素，抗生素。结果发现移植治疗MCT大鼠组肺动脉压轻度下降。

　　3 转染基因

　　种子细胞可以做为载体，承载基因，目前已用于转染的基因有肾上腺髓质素(AM)、一氧化氮合酶、血管内皮生长因子、降钙素基因相关肽等，显示出较单纯种子细胞移植更良好的治疗效果。有研究[4]表明脐血EPCs转染肾上腺髓质素，分为3组细胞移植到MCT大鼠：EPCs组、AM-EPCs组和培养基组，结果EPCs组平均肺动脉压轻度下降，而AM-EPCs组明显下降，且后者表现为比前者明显的肺血管阻力下降。AM-EPCs组右心室压力和右心室重量较其它组明显下降。移植2周后AM-EPCs组血浆及肺组织中AM水平明显增高。Kaplan-Meier存活曲线证实AM-EPC组较其他组具有明显高的生存率。

　　Sachiko等[5]采用寡肽聚合酶链式反应(PCR)方法，取SD大鼠骨髓间充质干细胞，以大鼠心脏cDNA为模版，扩增内皮NO合酶(eNOS)全长片段，采用腺病毒转染， MCT注射制作PAH模型，将大鼠分为三组，一周后第一组单纯注射1×106个MSCs，第二组注射5×105个转染eNOS的MSCs，第三组不进行治疗。MCT注射后三周显示第一组/第二组右室收缩压(RVSP)明显降低，且第二组较第一组更低，存活时间也比未治疗组更长。Andrew等[6]研究显示转染血管内皮生长因子可改善MCT诱导的PAH。

　　Zhao等[1]采用体细胞载体的eNOS或者各种血管形成因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素-1，能够减轻MCT诱导的PAH，可能保护内皮细胞免于凋亡或者诱导微血管形成。而且当应用到肺动脉高压鼠时，伴随肺微循环恢复的证据，与现在已经广泛接受的eNOS和NO在血管形成方面的作用一致。

　　国内上海中山医院Zhao等[7]采用腹主动脉-下腔静脉分流法10周诱导大鼠PAH，分离人外周血内皮细胞，以人表达质粒转染降钙素基因相关肽，由大鼠颈外静脉移植，4周后平均肺动脉压及总肺血管阻力均下降。结论是转染降钙素基因相关肽的内皮细胞可以减轻PAH，对肺血管重塑具有逆转作用。

　　4 移植方法

　　干细胞移植治疗PAH的途径主要为经静脉注入循环再到肺组织[1]，也有经气道移植[3]和经气道直接注射肺组织的途径[8]。Sachiko 等[5]认为实验证实静脉注射eNOS基因转导的MSCs细胞可改善MCT诱导的PAH引起右心室功能减退。MCT诱导的PAH模型与原发性PAH相似，由肺动脉内皮损伤至基质增厚。

　　Takahashi等[8]第一次以气道方式注射治疗MCT诱导PAH的实验，通过支气管镜用改良的27号针注射EPCs到狗气管周围的肺实质，移植的EPCs取自自体外周血并进行体外扩增，试验组n=4;对照组注射细胞培养基n=3;EPC移植组肺动脉压力、心输出量和肺血管阻力明显改善，组织学观察显示，小动脉中层血管厚度和新生血管形成得到改善。Baber等[3]研究，对MCT诱导PAH的大鼠气管内注射MSCs的效果及其损伤的内皮依赖反应。注射MCT 2周后气管内注射3×106个MSCs减轻了肺动脉压力和肺血管阻力上升，修复了肺血管对乙酰胆碱的反应，同时减轻了右心室的肥厚。免疫组织化学染色显示气道周围的肺实质中广泛分布着标记的MSCs，并提示移植的MSCs保留vWF因子和平滑肌肌动蛋白。

　　5 作用机制

　　大部分研究认可移植的EPCs整合到肺动脉内皮层[1]，然而也有不同的看法，Makoto[9]采用未分离的骨髓细胞移植治疗MCT大鼠加左肺切除的PAH模型时，虽然见到到达内皮层的细胞是中层的十倍，但是还是相当少的细胞整合到内皮层，原因可能是种子细胞的来源不同，即为未分离的骨髓细胞。而Baber[3]认为通过气道移植MSCs的MCT大鼠中，肺血管对乙酰胆碱内皮依赖扩张剂的反应的阻力的改善可能是因为移植到肺实质中干细胞内分泌的结果，改进了肺血管内皮功能。广泛移植到MCT肺高压鼠的细胞可存活至少21 d。对于作用机制原研究还不够深入，存在争论。

　　6 临床应用

　　可喜的方面，我国浙江医科大学Wang等[10]将其应用到临床治疗并取得良好的治疗效果。选择特发性肺动脉高压病人，诊断依据临床评估、右心导管、超声心动图、螺旋CT、肺血管造影、及肺通气灌注扫描、肺功能测试，心功能NYHA 2～3级，平均肺动脉压力大于30mmHg(1mmHg=0.133kPa)、6 min行走测试大于等于50 m。每个病人抽取250ml外周血，通过Ficoll密度梯度离心法获取单核细胞，培养在纤维连接蛋白包被的培养皿中，M199培养基含20%人血清，牛脑垂体浸液，血管内皮生长因子50ng/ml。90%的细胞显示DiI-acLDL阳性;以(1.1±0.6)×107个单核细胞悬液静脉注入，共31例病人，随机选取16例进行传统治疗，15例进行细胞灌注加传统治疗。随访12周，细胞灌注组6 min平均行走距离增加48.2m，而传统治疗组增加5.7m，两组之间平均差别42.5m，细胞灌注组肺动脉压、肺血管阻力和心输出量明显改善，且未发生严重事件。该研究显示静脉注射自体EPCs细胞是可行的、安全的，并且具有增加IPAH患者运动能力和改善肺动脉血流动力学的益处。

　　7 问题与展望

　　总而言之，干细胞及联合基因转染移植治疗PAH正处在热点研究中，但尚存在移植细胞没有出现再生，供体样品中有其他少量干细胞的掺入，移植后细胞融合等诸多问题,且各种移植途径、效果及机制还待进一步研究，临床应用还需建立在良好的基础研究和动物实验基础之上。

　　【参考文献】

　　[1]Zhao YD, Courtman DW, Deng Y,et al. Rescue of monocrotalineinduced pulmonary arterial hypertension using bone marrowderived endotheliallike progenitor cells[J]. Circ Res，2005，96: 442-450.

　　[2]Nagaya N, Yokoyama C, Kyotani S,et al.Gene transfer of human prostacyclin synthase ameliorates monocrotalineinduced pulmonary hypertension in rats[J]. Circulation，2000，102: 2005-2010.

　　[3]Baber SR，Deng W, Master RG,et al. Intratracheal mesenchymal stem cell administration attenuates monocrotalineinduced pulmonary hypertension and endothelial dysfunction[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，292: H1120-H1128.

　　[4]Nagaya N, Kangawa K, Kanda M,et al. Hybrid cellgene therapy for pulmonary hypertension based on phagocytosing action of endothelial progenitor cells[J]. Circulation，2003，108: 889.

　　[5]Sachiko KH, Hitoshi H,Shigetoshi M,et al. Implantation of mesenchymal stem cells overexpressing endothelial nitric oxide synthase improves right ventricular impairments caused by pulmonary hypertension[J].Circulation，2006，114: I181-I185.

　　[6]Andrew IM,Campbell,Yidan Z,et al. Cellbased gene transfer of vascular endothelial growth factor attenuates monocrotalineinduced pulmonary hypertension[J].Circulation,2001，104: 2242-2248.

　　[7]Zhao Q， Liu Z, Wang Z,et al. Effect of preprocalcitonin generelated peptide expressing endothelial progenitor cells on pulmonary hypertension[J]. Ann Thorac Surg,2007，84(2):544-552.

　　[8]Takahashi M, Nakamura T, Toba T,et al. Transplantation of endothelial progenitor cells into the lung to alleviate pulmonary hypertension in dogs[J].Tissue Eng,2004，10(5-6): 771-779.

　　[9]Makoto S，Masataka S，Toshihiro M,et al.Diverse contribution of bone marrow derived cells to vascular emodeling associated with pulmonary arterial hypertension and arterial neointimal formation[J]. Circulation，2007，115:509-517.

　　[10]Wang XX, Zhang FR, Shang YP,et al.Transplantation of autologous endothelial progenitor cells may be beneficial in patients with idiopathic pulmonary arterial hypertension: a pilot randomized controlled trial[J].J Am Coll Cardiol,2007，49(14): 1566-1571.