MMP9、OPG在风湿钙化二尖瓣的表达及意义

　　作者：白传明,张彬,张志刚,宋书田,周岊梧　　作者单位：河北省沧州市中心医院心胸外科　，麻醉科　;河北省沧州市人民医院病理科

　　【摘要】 　　目的 观察基质金属蛋白酶9(MMP9)和骨保护素(OPG)在风湿钙化二尖瓣的表达。方法 将手术切取下的二尖瓣共42枚，按病史分为风湿钙化组(24枚)和非风心病组(18枚)。采用SP法进行免疫组化染色观察基质金属蛋白酶9和骨保护素在2组的表达。结果 在风湿钙化组，基质金属蛋白酶9和骨保护素表达均明显高于非风心病组(P<0.01)。结论 风湿瓣膜的钙化与基质金属蛋白酶9所引起的细胞外基质降解和重塑以及骨保护素所诱导的成骨样骨形成密切相关。

　　【关键词】 基质金属蛋白酶9,骨保护素,风湿,钙化,二尖瓣

　　【Abstract】 Objective To observe the expression and significance of matrix metalloproteinase9 and osteoprotegerin in calcified mitral valves of rheumatic heart disease.Methods 42 mitral valves cut by operation were divided into calcified rheumatic group and noncalcified rheumatic group，and the expression of matrix metalloproteinase9 and osteoprotegerin was observed by immunohistochemistry method.Results The expression of matrix metalloproteinase9 and osteoprotegerin in calcified rheumatic group significantly increased than that in non calcified rheumatic group(P<0.01).Conclusion Both matrix metalloproteinase9 and osteoproteger are highly expressed in calcified rheumatic group，which proves that calcify of rheumatic mitral valves is related with the degradation and remodeling of extra cellular matrix by matrix metalloproteinase9，and closes with osteoblastlike bone formation by osteoprotegerin.

　　【Key words】 matrix metalloproteinase9;osteoprotegerin;rheumatic;calcify; mitral valve

　　目前，我国风湿性心脏瓣膜病在心脏疾病中仍占有很高的比例。风湿性心脏瓣膜病变的主要病理改变为瓣叶的增厚、挛缩、纤维化及不同程度的钙化，从而导致瓣口面积减小和关闭不全。虽然前人对此已经做了大量研究，然而其病理形态的发生机制尚不清楚。基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9，MMP9)是一种锌离子依赖性明胶酶，可降解细胞外基质成分，在骨骼发育及骨关节炎的研究中发现其可降解胶原和蛋白聚糖，引起细胞外基质重塑，同样这一发现在退行性主动脉瓣钙化的研究中得到了证实，但对于风湿性二尖瓣的研究尚未有过。骨保护素(osteoprotegerin，OPG)做为一种可溶性肿瘤坏死因子(TNF)受体，在骨代谢方面的研究日益受到人们的重视。本研究旨在观察MMP9、OPG在风湿钙化二尖瓣的表达。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　来自2007年6月至2008年10月我院行二尖瓣置换手术所切除之瓣膜，共42枚，依病史分为风湿钙化组(24枚)和非风湿钙化组(18枚)。

　　1.2 方法

　　将手术切取下的二尖瓣取25 mm2瓣叶组织制成蜡块，切片SP法免疫组织化学染色观察MMP9和OPG的表达。

　　1.3 评定标准

　　细胞浆中出现棕黄色颗粒即为阳性细胞。参考Mohsin等[1]报道的标准进行改良，采用阳性细胞比例和着色强度两项综合评定阳性结果，故采用计分法，即阳性细胞数<25%计0分、25%～50%计1分、51%～75%计2分、>75%计3分;轻度着色计1分、中度着色计2分、重度着色计3分。每张切片的两项得分之和为该病理阳性结果。<3分的为阴性、≥3分的阳性。

　　1.4 统计学分析

　　应用SPSS 11.5统计软件，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　风湿钙化组MMP9和OPG的阳性表达率与非风心病组比较差异有统计学意义(χ2值分别为21.034和21.073，P<0.01)。见表1，图1～4。表1 2组MMP9和OPG阳性结果比较(略)注：与非风湿钙化组比较，*P<0.01

　　3 讨论

　　风湿热侵犯心脏瓣膜，引起瓣膜增厚、变硬、卷曲、缩短和钙化，引起瓣口面积狭小和关闭不全，从而引起严重的血流动力学改变，但引起瓣膜钙化的机制尚不清楚。MMP9和OPG在近年来骨代谢研究领域日益受到人们的关注，然而其在风湿钙化瓣膜方面的研究笔者尚未见报道。

　　MMP9 是一种锌依赖性肽链内切酶，属于Ⅳ型胶原酶，又称明胶酶B，在体内可由多种细胞合成，以无活性的酶原形式分泌，经血浆酶切断其N2端被激活，主要参与细胞外基质的降解与重塑。其作为降解血管基底膜的主要成分Ⅳ型胶原的主要酶类，和动脉粥样硬化的发生发展密切相关。近年来研究表明MMP9与动脉粥样硬化斑块钙化并加重主动脉狭窄有关[2]。Kaden等[3]报道MMP在正常主动脉瓣中以酶原的形式存在，在钙化瓣膜中被激活。在本研究中发现风湿钙化的瓣膜组织中MMP9明显高于对照组(P<0.01)，考虑与MMP9降解细胞外基质和基底膜成分，引起瓣膜增厚，导致钙盐沉积有密切关系。Fondard等[4]研究发现MMP9在主动脉瓣狭窄的瓣膜组织中表达明显增高，并且认为MMP9并非为瓣膜间质细胞所分泌，而是主要来源于巨噬细胞。风湿热引起心脏瓣膜的炎性反应，可使瓣膜内皮不同程度受损，基底膜和胶原纤维暴露出来，胶原纤维增生致密，并引起受损部位的内皮细胞及黏附的淋巴细胞、血小板等合成并释放多种细胞因子，如生长因子、趋化因子，这些因子可作用于内皮细胞、单核巨噬细胞，诱导其表达MMP9增多。过度表达的MMP9大量降解瓣膜的细胞外胶原和蛋白聚糖，引起细胞外基质代谢紊乱，导致瓣膜结构重塑，弹性下降，僵硬度增加。同时MMP9在瓣膜内皮下聚积可进一步加重其损害，内皮层的破损使钙滤过增加并沉积到组织深层，继而基底膜和胶原纤维暴露出来，胶原纤维增生，钙盐通过破损的内皮沉积到组织深层使得瓣膜增厚钙化。

　　OPG是含4～5个潜在糖化位点的分泌型糖蛋白，为TNF 受体超家族成员，又称破骨细胞形成抑制因子。OPG mRNA 广泛表达于多种组织和细胞系，成年人心、肺、肾和骨组织合成OPG 较多，胎盘、肝脏、甲状腺、脊髓、脑、脾、前列腺和胃肠道等也可合成。体外培养条件下高表达OPG的细胞系有成骨细胞谱系、内皮细胞、成纤维细胞、树突状细胞、B淋巴细胞和多种肿瘤细胞株等。OPG 的生物学效应主要表现为抑制破骨细胞的分化和成熟，从而抑制骨吸收。对转基因小鼠研究表明，过表达OPG的小鼠出现严重的骨硬化，伴骨髓腔缩小而致代偿性骨髓外造血，全身小梁骨矿化增加，破骨细胞数目明显减少。Hofbauer 等[5]进一步研究发现，过表达OPG的小鼠表现为早期、进行性大理石样骨病，病变累及长骨、脊椎骨和骨盆等多个部位。因此我们推测风心病导致的瓣膜钙化可能与OPG的表达有关。本研究发现，在风湿钙化组的瓣膜表达OPG增多。Deckers等[6]研究发现血管内皮生长因子可通过吸引内皮细胞和刺激成骨细胞分化而调节骨的生成。Rajamannan[7]等研究发现在风湿钙化的瓣膜有内皮生长因子的表达和成骨细胞的标记物以及局部有血管内皮生长因子和新生血管的表达。因此他们认为风湿钙化的瓣膜不是简单的钙盐在局部的沉积，而是一种成骨细胞样骨生成改变。Kim等[8]研究发现在风湿性心脏病患者的瓣膜中转化生长因子β(TGFβ)表达上调，而TGFβ可增强OPG mRNA的表达[9]。风湿热引起瓣膜局部炎症改变，大量IL和TNF等炎症因子生成与释放增多，可能是OPG表达上调的因素之一。此外，在炎症愈合后，风湿细胞转变为成纤维细胞与成骨细胞同表达OPG。而过表达的OPG又通过抑制破骨细胞的分化进一步加剧局部组织的矿化。

　　通过我们的研究发现在风湿钙化瓣膜组织中，MMP9和OPG均呈现高表达，说明风湿性心脏瓣膜钙化与MMP9引起的细胞外基质代谢紊乱以及OPG诱导的成骨样骨形成密切相关，而并非简单的钙盐沉积，由此提示我们是否可以通过抑制细胞外基质降解和重塑以及瓣膜的成骨样形成，从而延缓或治疗风湿性心脏病的瓣膜钙化，为以后在风湿性心脏瓣膜病方面的研究开辟新的思路。

　　【参考文献】

　　1 Mohsin SK，Zhang M，Clark GM，et al.Maspin expression in invasive breast cancer：association with other prognostic factors.J Pathol，2003，199：432435.

　　2 Jian B，Jones PL，Li Q，et al.Matrix metalloproteinase2 is associated with tenascinC in calcific aortic stenosis.Am J Pathol，2001，159：321327.

　　3 Kaden JJ，Vocke DC，Fischer CS，et al.Expression and acti vity of matrix metalloproteinase2 in calcific aortic stenosis.Z Kardiol，2004，93：124130.

　　4 Fondard O，Detaint D，Lung B，et al.Extracellular matrix remodelling in human aortic valve disease：the role of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors.Eur Heart J，2005，26：13331341.

　　5 Hofbauer LC，Heofelder A E.Osteoprotegerin and its cognateligand：a new paradigm of osteoclastogenesis.Eur J Endo，1998，139：152154.

　　6 Deckers MM，Bezooijen RL，Horst G，et al.Bone morphogenetic proteinsstimulate angiogenesis through osteoblastderived vascular endothelialgrowth factor A.Endocrinology，2002，143：15451553.

　　7 Rajamannan NM，Nealis TB，Subramaniam M，et al.Calcified rheumatic valve neoangiogenesis is associated with vascular endothelial growth factor expression and osteoblastlike bone formation.Circulation，2005，111，32963301.

　　8 Kim L，Kim DK，Yang WC，et al.Overexpression of transforming growth factor1 in the valvular fibrosis of chronic rheumatic heart disease.J Korean Med Sci，2008，23：4148.

　　9 Thirunavukkarasu K，Miles RR，Halladay DL，et al.Stimulation of osteoprotegerin(OPG)gene expression by transforming growth factorbeta(TGFbeta).Mapping of the OPG promoter region that mediates TGFbeta effects.J Bio Chem，2001，276：3624136250.