Survivin在食管鳞癌发生发展中的作用

　　作者：杨增周,席鸿钧,侯进荣　　作者单位：林州市人民医院胸外科，河南 林州 新乡医学院第一附属医院胸外科，河南 卫辉

　　【摘要】 目的 研究Survivin在食管正常黏膜、不典型增生及食管鳞癌中的表达，分析Survivin蛋白表达与患者临床病理特征及预后之间的关系。方法 83例食管鳞癌患者采用免疫组织化学方法检测Survivin蛋白在不同病变组织中的表达情况，随访5 a以上。结果 Survivin蛋白在正常黏膜、不典型增生及鳞癌组织呈渐进性高表达(P<0.001)。Survivin蛋白表达与食管癌的浸润程度、pTNM分期显著相关(P<0.05)。Survivin阳性表达患者的5 a生存率明显低于阴性表达患者(P<0.05)，Cox回归模型多因素分析显示，Survivin阳性表达是影响食管癌患者术后生存的独立预后因素(RR=3.125，P<0.05)。结论 Survivin表达与食管癌的发生发展密切相关，可作为食管癌早期诊断指标;Survivin表达可能是影响食管癌患者预后的独立因素。

　　【关键词】 Survivin,食管鳞癌,免疫组织化学;预后

　　Abstract: Objective To study the expression of Survivin proteins in normal esophageal mucosa，atypical hyperplasia tissue and esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and to analyze the relationship between protein expession and clinicopathologic characteristic.Methods The expression of Survivin in different pathological changed tissue of 83 cases with esophageal squamouscelled carcinoma was detected by immunohistochemistry,and they all followed up more than 5 years.Results The expression of Survivin were progressively increasing in the course from normal、atypical hyperplasia to squamous cell carcinoma(P<0.001).It was significantly correlated with tumor infiltration depth and pTNM staging(P<0.05).The 5year overall survival rate of Survivin positive patients was lower than that of Survivin negative patients(P<0.05);By Cox regression model multivariate analysis， the positive expressin of Survivin was the independent prognostic factors for ESCC patients(RR=3.125，P<0.05).Conclusion The expression of Survivin was significantly related to the occurrence and progression of ESCC， it may be an important marker for ESCC early diagnosis，and it may be an independent prognostic indicator for ESCC patients.

　　Key words: Survivin;esophageal squamous cell carcinoma;immunohistochemistry;prognosis

　　食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其病死率占我国恶性肿瘤的第4位[1]。由于缺乏敏感、特异的早期诊断和生物防治的指标和方法，临床上以中、晚期患者为主，其5 a生存率约30%左右，而早期癌可达90%左右[24]，提高食管癌的早期诊断和治疗水平是食管癌防治工作的重要任务。Survivin是肿瘤凋亡抑制蛋白(inhabitor of apoptosis protein，IAP)家族的一名新成员[5],所有的肿瘤组织中高表达，却不见于终末分化成熟的正常组织(胸腺、生殖腺除外)[6]。Survivin这种独特的表达特点为肿瘤的早期诊断和基因治疗提供了新的靶点，成为肿瘤研究领域中新的热点。本研究应用免疫组织化学技术检测Survivin在食管不同病变中的表达情况，探讨Survivin在食管癌发生发展中的作用，为食管癌的早期诊断提供理论依据和指标。

　　1 资料与方法

　　1.1 对象 标本来自1998年至1999年林州市人民医院胸外科手术切除、病理科存档且随访调查资料完整的83例林州市患者的食管鳞癌蜡块。其中原位癌13例，进展期癌70例。术前未接受放射或化学治疗等抗肿瘤治疗，随访均在5 a以上。另取癌旁食管正常黏膜30例、不典型增生上皮30例做对照。

　　1.2 组织处理 所有组织均经体积分数10%的福尔马林固定、石蜡包埋。蜡块标本连续4 μm切片，平贴在涂有3-氨丙基-3-已氧基甲硅烷的载玻片上，作免疫组织化学染色。

　　1.3 试剂与方法 兔抗人Survivin多克隆抗体(sc10811)，工作浓度1175，购自Santa Cruz Biochemology，Inc。采用Pv9000二步法非生物素免疫组织化学检测试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。具体操作按说明书严格进行。所有切片均经0.01 mol•L-1柠檬酸缓冲液作高温高压抗原修复。一抗均4 ℃过夜，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS) 代替一抗作为空白阴性对照。

　　1.4 结果判定 以胞核或胞质出现棕黄色染色为阳性表达。每例切片高倍镜下(×40)计数至少5个随机视野，取平均值。阳性细胞数<5%为(-);5%～25%为(+);>25%为(++)。

　　1.5 统计学处理 应用SPSS 10.0软件进行数据处理。Survivin蛋白表达与临床病理因素之间的关系采用χ2检验或KruskalWallis检验。2个变量相关性分析采用Spearman等级相关分析。对食管癌患者的生存资料进行KaplanMeier分析，生存率比较用Logrank检验。将性别、年龄、浸润程度、淋巴结转移、分化程度、pTNM分期、Survivin表达7种因素作为自变量，生存时间作为因变量，量化后进行拟合Cox模型逐步回归分析。显著性水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 免疫组织化学染色结果 Survivin阳性产物主要位于细胞核，呈棕黄色。83例食管癌中胞核呈阳性表达者31例，胞质胞核共表达有12例(见图1)，未见单纯胞质中表达;其中13例原位癌均为胞核强阳性表达(见图2)。Survivin阳性产物在正常食管黏膜组局限性分布于上皮基底层细胞核(见图3 );在不典型增生组散在分布于增生细胞核中(见图4)。Survivin阳性率随细胞异型程度的加重而增高，Survivin阳性表达率在正常黏膜组、不典型增生组、鳞癌组分别为10.0%(3/30)、30.0%(9/30)、51.8%(43/83)，3组之间有显著差异(P<0.001);Survivin表达强度在正常食管黏膜组和不典型增生组仅为“+”级，而在鳞癌组为“+～++”级，与正常食管黏膜和不典型增生组之间有显著性差异(P<0.001)。

　　2.2 Survivin表达与食管鳞癌临床病理参数的关系 Survivin阳性表达在患者不同分化程度、区域淋巴结转移之间的分布差别无统计学意义(P>0.05);但在不同浸润程度、pTNM分期之间的分布差别有统计学意义(P<0.05)，见表1。Spearman等级相关检验显示，Survivin表达与浸润程度(r=0.337，P<0.01)、pTNM分期显著相关(r=0.337，P<0.05)。表1 Survivin蛋白表达与食管鳞癌临床病理特征的关系

　　2.3 Survivin表达与食管癌患者预后的关系 40例Survivin表达阴性患者中2例死于冠心病，22例死于肿瘤复发和转移;43例Survivin表达阳性患者中2例死于脑梗死，32例死于肿瘤复发和转移。KaplanMeier生存分析显示：Survivin表达阳性患者的平均生存时间为37个月，阴性患者的平均生存时间为49个月。Survivin表达阳性患者的5 a累积生存率为25.58%，阴性患者的5 a累积生存率为44.74%。Logrank检验：阳性表达患者的5 a生存率明显低于阴性患者(χ2=5.78，P<0.05)。Cox模型逐步回归分析显示:淋巴结转移(RR=5.132，P<0.001)、pTNM分期(RR=3.259，P<0.01)、Survivin表达(RR=3.125，P<0.05)是影响食管癌患者预后的独立因素。

　　3 讨论

　　Survivin是肿瘤凋亡抑制蛋白(inhabitor of apoptosis protein，IAP)家族的一名新成员[78]，是1997年Ambrosini G等利用效应细胞蛋白酶受体1的cDNA在人类基因组库中筛选克隆出来的[5]。Survivin基因位于17q25染色体[9]，全长约15 kb，有4个外显子和3个内显子组成，编码含有142个氨基酸组成的分子量约16.2 kb浆蛋白;它在胚胎和几乎所有的癌组织中表达，不见于终末分化成熟的正常组织(胸腺、生殖腺除外)[6]。目前研究认为，Survivin蛋白可能同时具有调控细胞凋亡和细胞增殖的双重功能[10]。作为IAP家族中的成员，Survivin可能通过抑制胞浆中Caspase3和Caspase7的活性，阻断细胞的凋亡过程，从而使细胞获得永生性[11]。但有反对者认为Survivin的结构难于和Caspase3直接结合，提示Survivin的抗凋亡作用可能不是通过抑制胞浆中的Caspase3的活性实现，而是通过胞核中的其他途径[12]。有研究认为，Survivin可以依赖细胞增殖信号介导而进入核内，与细胞周期调节因子CDK4结合，形成SurvivinCDK4复合体，使P21蛋白自CDK4释放，P21进一步与线粒体中Caspase3结合，抑制其活性，进而抑制细胞凋亡[13]。同时，作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(cyclindependent kinase inhibitor，CKI)重要成员的P21的解离使周期蛋白依赖性激酶CDK4活化，形成周期蛋白CyclinD和CDK4复合物，促使细胞通过G1期进入S期，促进细胞增殖[1314]。Ito等[15]在肝细胞癌的研究认为Survivin的主要功能并不是胞浆中的Caspase3依赖的抗凋亡作用，而是细胞周期阶段促增殖的功能。另有研究发现Survivin主要优先分布在胞浆，而其变异体SurvivinΔEx3优先位于胞核[16]，后者也有正常的抗凋亡功能[17]。

　　Survivin在食管癌中的研究较少，其亚细胞分布状况及其在食管癌发生中的作用仍不确定。有报道发现Survivin只表达于细胞质[1819]，亦有报道发现细胞质和细胞核均有Survivin的表达[2022]。本研究发现，Survivin在70例进展期癌中可见胞核、胞核胞质共表达。未见有单纯的胞质表达，可能与本实验核表达较强而掩盖了胞质表达有关。30例正常黏膜上皮基底细胞中均有程度不同的核表达，达到阳性判断标准的仅3例;在不典型增生组，Survivin散在性分布于增生的细胞核中;13例原位癌均为胞核强阳性表达。对此作者分析认为，Survivin蛋白可能与基底细胞和不典型增生细胞分裂增殖活跃有关;原位癌中细胞分裂增殖能力进一步增强，使癌细胞变得富有侵袭性。本实验结果同时显示，从正常黏膜到不典型增生和鳞癌，Survivin表达的阳性率依次为10.0%、30.0%、51.8%，提示Survivin可能早期参与了食管癌的发生过程，Survivin阳性表达的正常和增生黏膜上皮存在癌变的可能，Survivin具有早期诊断的价值。实验中的正常黏膜均取自于癌旁正常上皮，其可能已发生了生物学的改变，对生物学上真正意义的正常黏膜的研究将有助于进一步了解Survivin在食管鳞癌发生发展中的作用。

　　Grabowski P[21]、 Ikeguchi M等[23]研究发现Survivin高表达与食管癌患者的预后不良有关。本研究发现Survivin表达与食管癌浸润程度和pTNM分期显著有关，Survivin表达阳性患者的5 a生存率与阴性患者有显著差异，提示Survivin表达阳性患者的预后不良。Cox模型逐步回归分析显示Survivin表达可作为一种独立的预后因素，与益新娜等[20]的研究趋于一致。说明肿瘤组织中可能由于Survivin的凋亡抑制和细胞增殖作用，癌细胞可以一直恶性分裂，促使肿瘤向周围浸润和蔓延，进而影响患者的预后。

　　综上所述，作者认为，Survivin表达是食管癌发生的早期事件;Survivin蛋白的合成部位在胞质，但其作用部位可能在胞核;Survivin的主要功能可能不是胞浆中的Caspase3依赖的抗凋亡作用，而可能是进入核内发挥促细胞增殖的功能。总之，Survivin基因的再活化及表达使肿瘤细胞的凋亡作用减弱、增值作用增强，使肿瘤细胞获得生长优势，浸润性增强，恶性度升高，这或许是导致Survivin表达组患者预后差的原因。对Survivin的作用机制，细胞分布状态等特征的深入研究将为食管癌等肿瘤的早期诊断和治疗开辟新的途径。

　　【参考文献】

　　[1] 路 平,李 荣,梁秋冬,等.中药对食管癌术后患者生活质量和免疫功能的影响[J].新乡医学院学报，2006，23(2)：121122.

　　[2] 吴君旭,王景祥,刘 波.胸段食管癌颈、胸、腹三区域淋巴结清扫术临床应用[J].中国临床保健杂志，2006，9(4)：338339.

　　[3] 杨增周,席鸿钧,侯进荣.血管内皮生长因子C及血管内皮生长因子受体3在高发区食管鳞癌淋巴结转移中的作用[J].新乡医学院学报,2008,25(1):1519.

　　[4] 王立东.食管癌变多阶段演进的分子机制[J].新乡医学院学报，2007，24(3)：217222.

　　[5] 崔 云,刘文霞,李占全.Survivin与淋巴瘤的研究进展[J].新乡医学院学报，2007，24(6) 636639.

　　[6] Ambrosini G，Adida C，Altier D.A novel antiapoptosis gene:Survivin，expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med，1997，3:917921.

　　[7] 姜 忠,杨传民,江布先.凋亡相关蛋白Survivin、Fas在肾母细胞瘤中的表达及其临床意义[J].实用儿科临床杂志,2006,21(11):668669,712.

　　[8] 宋艳清,胡 群,潘华雄,等.急性白血病患儿骨髓细胞环氧合酶2和survivin表达及其意义[J].实用儿科临床杂志，2007，22(15)：11351137.

　　[9] 刘 静,张柳清,胡 群,等.Survivin、细胞周期素依赖激酶4、细胞增殖相关抗原在急性白血病患儿中表达的意义[J].实用儿科临床杂志,2006,21(9):545546.

　　[10] 侯 燕,胡 群.Survivin与癌基因相互作用对儿童白血病细胞凋亡的影响[J].实用儿科临床杂志,2006,21(5):310312.

　　[11] Shin S，Sung BJ，Cho YS，et al.An antiapoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of Caspase3 and caspase7[J].Biochemistry，2001，40(4):11171123.

　　[12] Verdecia M A，Huang H，Dutil E，et al.Structure of the human antiapoptotic protein survivin reveals a dimeric arrangement[J].Nat Struct Biol，2000，7(7):602608.

　　[13] Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates ptrocapase 3/P21 complex formation as a result of interaction with CDK4 to resist Fasmediated cell death[J].Oncogene，2000，19:13461353.

　　[14] Suzuki A，Hayashida M，Ito T，et al.Survivin initiates cell cycle entry by the competitive interaction with Cdk4/p16( I8NK4a ) and Cdk2/cyclinE complex activation[J].Oncogene，2000，19(29):32253234.

　　[15] Ito T，Shirak K，Sugimoto K，et al.Survivin promotes cell proliferation in human hepatocelluar carcinoma[J].Hepatology，2000，31:10801085.

　　[16] Rodriguez JA，Span SW，Ferreira CG，et al.CRM1Mediated Nuclear Export determines the Cytoplasmic Localization of the antiapoptosis protein Suvivin[J].Exp Cell Res，2002，275:4453.

　　[17] Mahotka C，Liebmann J，Wenzel M，et al.Differential subcellular localization of functionally divergent Survivin splice variants[J].Cell Death Differ，2002，9:13341342.

　　[18] Adida C，Berrebi D，Peuchmaur M，et al.Antiapoptosis，gene，survivin，and prognosis of neuroblastoma[J].Lancet，1998，351(9106):882.

　　[19] 任秀花，张孝艳，阎爱华，等.PTEN、Survivin在食管癌发生发展中的作用[J].河南肿瘤学杂志，2004，17(4)：238240.

　　[20] 益新娜，王立东，宋子博，等.河南食管癌高发区居民食管癌组织中Survivin蛋白的表达[J].郑州大学学报：医学版，2004，39(6)：953956.

　　[21] Grabowski P，Kuhnel T，MuhrWilkenshoff F，et al.Prognostic value of nuclear survivin expression in oesophageal squamous cell carcinoma[J].Br J Cancer，2003，88(1):115119.

　　[22] Nemoto T，Kitagawa M，Hasegawa M，et al.Expression of IAP family proteins in esophageal cancer[J].Exp Mol Pathol，2004，76(3):253259.

　　[23] Ikeguchi M，Kaibara N.survivin messenger RNA expression is a good prognostic biomarker for oesophageal carcinoma[J].Br J Cancer，2002，87(8):883887