NOS3基因多态性与脑卒中合并高血压关系的研究

　　作者：高鹏 杜丹华 赵节绪 吴 江 作者单位：吉林大学第一医院神经内科，吉林 长春 130021

　　【摘要】目的 探讨NOS3基因多态性与脑卒中合并高血压发病的关系。方法 以rs3918181位点为遗传标记，采用聚合酶链反应(PCR)和限制性片断长度多态性(RFLP)检测613例脑卒中患者和323例对照人群NOS3基因的多态性。结果 脑卒中组和对照组的rs3918181位点等位基因、基因型频率无显著差异;以是否合并高血压对病例组人群进行分群后，cocaphase分析表明合并高血压的脑卒中组rs3918181位点的A等位基因频率较单纯脑卒中组明显增高(P=0.034)。合并高血压的脑卒中组AA+AG基因型的频率明显高于单纯脑卒中组(P=0.041)。结论 NOS3基因与脑卒中的发病无关，而可能与高血压的发生相关。

　　【关键词】 内皮细胞型一氧化氮合酶(NOS3) 单核苷酸多态性 脑卒中 高血压

　　遗传学研究表明，脑卒中是多基因遗传病，遗传因素是其发病的一个危险因素，动脉粥样硬化(AS)是其主要病因。内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)主要存在于血管内皮细胞，其催化生成的eNO可抑制血管内皮表面血小板和白细胞的黏附、聚集，抑制血管平滑肌细胞增生，因此是动脉粥样硬化重要的抑制因子。另有研究证实eNOS在调节血流量和血压方面有重要作用〔1〕，内皮细胞生成的eNOS扩散至血管平滑肌细胞和血流中，产生肌肉舒张、血管扩张和血流量增加，而敲除NOS3基因后，大鼠的血压升高〔2〕。由于脑卒中、高血压均与血管内皮功能异常有关，认为它们在发病机制上可能共用同一个遗传学通路。本文选择编码eNOS的NOS3基因是作为候选基因，探讨其基因多态性与合并高血压的脑卒中的关系。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 病例组住院并经头颅CT或MRI确诊的脑卒中患者，除外房颤、肿瘤等脑栓塞性疾病，除外肝肾功能不全，血液系统疾病，共613例，男435例，女178例，平均年龄(60.5±11.5)岁。根据患者是否合并高血压将病例组分为单纯脑卒中组和合并高血压的脑卒中组，两组间的性别、年龄相匹配。对照组为同期门诊体检人群，经病史询问无脑血管病史，部分经头颅CT或MRI证实，共323例，男200例，女123例，平均年龄(59.2±10.4)岁。所有入组对象均采集全血用于基因型鉴定。

　　1.2 方法 选择rs3918181(Rsa I site)单核苷酸多态性位点，采用限制性酶切片段多态性的方法对SNPs基因型进行分析。应用DNA提取试剂盒(Promega，北京)提取基因组DNA用于PCR扩增。引物序列：应用Primer5.0软件设计引物，上游引物：5′CAACAGTGCAGGTGAATCTCA3′,下游引物5′CAAACATTACCCGCATCCT3′，由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应体系为25 μl，其中双蒸水18 μl，10 mmol TrisHCl (pH 8.3)，50 mmol KCl，1.5 mmol MgCl2，4种dNTP各200 μmol，引物各0.4 μmol，Taq DNA 聚合酶(Promega，北京)1.0 U，基因组DNA 30～50 ng。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，55℃复性1 min，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。酶切体系：PCR产物以限制性内切酶(Promega，北京)于37℃水浴4～6 h酶切，经2%琼脂糖凝胶电泳(90 mV)30 min，在凝胶成像系统(UVP,美国)下观察结果。

　　1.3 统计学分析 应用拟和优度检验分析病例组和对照组基因型频率的分布是否符合HardyWeinberg(HW)平衡; UNPHASED遗传学软件应用cocaphase对等位基因频率进行分析;SPSS15.0软件应用卡方检验对基因型频率进行分析。

　　2 结 果

　　2.1 HardingWeinberg平衡分析 卒中组(χ2=0.006,P=0.939)和对照组(χ2=2.828，P=0.091)的基因型分布均未偏离HW平衡。

　　2.2 两组NOS3基因型及等位基因频率比较 脑卒中组与对照组NOS3基因型、等位基因频率比较差异不显著(P>0.05)(表1)。

　　2.3 合并高血压的脑卒中组和单纯脑卒中组NOS3基因型及等位基因频率比较 合并高血压的脑卒中组的AA+AG基因型频率(59.2%)明显高于单纯脑卒中组(50.5%)，差异有显著性(χ2=4.166,P=0.041,OR=1.421,95%CI 1.014～1.991)。合并高血压的脑卒中组的A等位基因频率(35.9%)显著高于单纯脑卒中组(29.9%)，差异有显著性(χ2=4.478,P=0.034,OR=1.315,95%CI 1.020～1.695)(表2)。

　　2.4 合并高血压的脑卒中组与单纯脑卒中组传统危险因素的比较 两组间的血脂、血糖等传统危险因素比较差异无显著性。表1 脑卒中组和对照组中NOS3基因型及等位基因频率的分布表2 合并高血压的脑卒中组和单纯脑卒中组NOS3基因型及等位基因频率的分布

　　3 讨 论

　　NOS3基因在人类染色体上定位于7号染色体长臂(7q36)，含有26个外显子和25个内含子，总长21 kb，编码1 203个氨基酸产物。研究发现，内含子是基因组中的一种重要调控元件，内含子可通过自身的剪接影响基因的表达，也可直接对基因的表达起调控作用。因此，本研究选择位于NOS3基因14号内含子上的rs3918181位点进行检测，该位点位于基因的中间，可以覆盖整个基因的连锁不平衡信号。

　　本研究未发现NOS3基因多态性与缺血性脑卒中的发病存在关联，但显示合并高血压的脑卒中人群过度传递了A等位基因，提示NOS3基因可能与高血压的发生有关。

　　目前关于NOS3基因多态性与高血压的研究多集中在7号外显子G894T突变和4号内含子处的可变串联重复〔3～7〕。Khawaja〔3〕和Srivastava〔4〕等研究发现G894T突变与高血压的发生相关。Moe等〔6〕研究认为4号内含子VNTR与高血压有关。本研究发现NOS3基因14号内含子rs3918181多态性与高血压的发生相关，进一步证实了NOS3基因与高血压发生的相关性。由于本研究结果的背景人群为北方汉族人，该结果需要在其它地区的人群中进行大样本的实验来验证。

　　【参考文献】

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　　4 Srivastava K, Narang R, Sreenivas V, et al. Association of eNOS Glu298Asp gene polymorphism with essential hypertension in Asian Indians〔J〕. Clin Chim Acta，2008;387(12): 803.

　　5 Zhang LP, Wang SZ, Zhao XX, et al. Association between endothelial nitric oxide synthase gene (G894T) polymorphism and essential hypertension in uygur populations〔J〕. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi, 2006;34(5):4036.

　　6 Moe KT, Lim ST, Wong P, et al. Association analysis of endothelial nitric oxide synthase gene polymorphism with primary hypertension in a Singapore population〔J〕. J Hum Hypertens,2006;20(12)：95663.

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