ERα基因多态性与Alzheimer病智能衰退的相关分析

　　作者：周伯荣 张惠敏 孙筱放 许治强 邓燕华 作者单位：广州医学院第三附属医院神经内科，广东 广州 510150

　　【摘要】目的 探讨中国汉族人群中雌激素受体(ER)α基因酶切多态性与散发性Alzheimer氏病(SAD)的发病及其智能衰退的相关性。方法 采用聚合酶链反应限制片段长度多态性方法，检测63例AD患者及70例健康对照老年人的ERαPvuⅡ、XbaⅠ酶切基因多态性;采用MMSE、ADL量表观察38例AD患者6个月的智能衰退状况与ERα基因多态性的关系。结果 AD组ERα等位基因x的频率、Pp、xx、Ppxx型较对照组明显增加，而PP、XX、PPXX型明显减少(P<0.05);XbaI酶切基因多态性xx、Ppxx与AD发病明显正相关(OR分别为2.34,95%CI 1.47～4.09和 1.79,95%CI 1.26～3.12)(P<0.05)。Pp与AD发病无明显相关(OR 1.58，95%CI 1.15～2.12)。ERа基因xx、Ppxx型与AD的智能衰退无明显相关性。结论 雌激素α受体xx或Ppxx基因型是SAD发病的危险因素，但与AD的智能衰退无明显相关性;ERαXbaⅠ基因酶切多态性xx型可能与中国汉族SAD的发病具有相关性。

　　【关键词】 雌激素受体α 基因多态性 Alzheimer氏病 智能衰退

　　研究发现，雌激素受体а的基因多态性与散发性AD(sporadic Alzheimer′s disease，SAD)的发病存在密切相关性〔1～4〕。但是，各地的研究结果存在明显不一致性，Brandi等〔2〕发现SAD患者ERа基因的X或P基因型较对照组明显增高，而最近的研究显示ERа基因的xx型与意大利人的AD发病相关〔3，4〕。但在中国人群中ERα的基因多态性与SAD的发病是否存在密切相关性，ERα基因多态性与AD的智能衰退是否相关，目前此类研究报道较少。本研究拟观察ERα基因多态性与AD发病及其智能衰退的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象 根据DSMⅣ的诊断标准，依据临床病史、症状、应用简易精神智力测定量表(MMSE)、日常生活功能评定量表(ADL)、汉密顿抑郁量表和Hachinski缺血量表筛选评定，并行神经系统体检和头颅MR或螺旋CT检查排除其他类型的痴呆，要求MMSE评分≥9分或≤20分，无亲缘关系，无明显消化系统疾病、冠心病、肝肾疾病者，获得临床诊断为可能性SAD患者63例，男24例，女39例，年龄58～70岁，平均(71.25±9.17)岁，MMSE评分90～20，平均13.25±5.74，ADL评分38～62，平均(45.70±10.05)，其中有轻度高血压病10例、糖尿病9例、高脂血症6例。对照组70例，均为体检中心全面检查合格的健康老年人，按痴呆组的年龄和性别比例分层随机抽样入组，男26例，女44例，平均年龄(70.58±8.20)岁，其中有轻度高脂血症患者18例。两组之间的平均年龄、性别比无明显统计学上的差异。共入组AD患者38例，男12例，女25例。采用MMSE、ADL分别于入组初期、入组后第3、6个月评定AD患者的智能状况。期间患者不使用胆碱脂酶抑制剂或其他脑神经营养剂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计与合成(上海生工生物有限公司合成) 雌激素受体序列：P1：5′CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC3′，P2：5′TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTC GATTATCTGA3′。 DNA分子量标准(Mark，深圳益生堂生物企业有限公司提供)：分子量由大到小顺序为2 000、1 600、1 200、800、600、400、200 bp。

　　1.2.2 雌激素受体基因型分析 全血基因组DNA提取采用快速提取法。聚合酶链反应(PCR)：雌激素受体反应体系共50 μl，无菌去离子水34.3 μl，10×PCR缓冲液5 μl，200 μmol/L dNTP 4 μl，引物为40 pmol,模板DNA 100 ng,TaqDNA聚合酶1 U。反应条件:预变性94℃ 3 min,94℃ 30 s，61℃ 40 s，72℃ 90 s，共35个循环，最后延伸72℃ 5 min，扩增产物大小为 1.3 kb。限制性内切酶酶切反应分别用PvuⅡ酶6 U、XbaⅠ10 U酶对雌激素受体PCR产物进行酶切反应,经1.2%琼脂糖溴乙锭凝胶电泳40 min,凝胶成像仪下判断结果并摄像。

　　1.3 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件对计数资料采用χ2检验，计量资料用x±s表示，采用Logiest多元回归进行多因素相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 雌激素受体基因多态型结果 用P或p、X或x表示,限制性内切位点存在者用小写字母表示,限制性内切位点缺失者用大写字母表示。使用PvuⅡ内切酶可区分三种基因型:PP(1.3 kb)、Pp(1.3 kb+850 bp +450 bp)、pp(850 bp+450 bp)，使用XbaⅠ内切酶可区分三种基因型:XX(1.3 kb)、Xx(1.3 kb+910 bp+390 bp)、xx(910 bp+390 bp)。见图1。

　　2.2 ER基因多态性、等位基因频率的分布 见表1。AD组基因型分布PP11.11%、Pp60.32%、pp28.57%;XX4.76%、Xx30.16%、xx65.08%;p和x等位基因频率为58.73%和80.16%。健康老年人群基因型分布分别为PP21.43、Pp48.57%、pp30.0%;XX15.71%、Xx37.14%、xx47.14%;p和x等位基因频率为53.57%和65.71%。其中以p、x基因位点居多。研究对象各基因型频率符合HardyWeinberg遗传平衡定律,具有群体代表性。ER基因ERαPvuⅡ、XbaⅠ酶切多态性的基因型频率分布发现ER基因ERαPvuⅡ、XbaⅠ2个酶切多态性位点在研究对象中存在连锁不平衡。

　　2.3 ER基因多态性与AD的相关性 见表1。AD组ERαPvuⅡ、XbaⅠ基因型与对照组之间存在显著性差异(P<0.05)。其中AD组Pp、xx型较对照组明显增加，而PP、XX型明显减少;经Logiest回归分析并调整高血压病、糖尿病、高脂血症的影响因素后xx与AD发病明显正相关，OR为2.34(95%CI 1.47～4.09),P<0.05。Pp与AD发病无明显相关，OR为1.58(95%CI 1.15～2.12)，PP、XX与AD无明显负相关。AD组等位基因x的频率明显增加(P<0.05);等位基因p的频率有增加，但无明显差异。联合基因分析结果示，AD组Ppxx型较对照组明显增加，而PPXX型明显减少，经Logiest回归分析并调整高血压病、糖尿病、高脂血症的影响因素后Ppxx与AD发病明显相关，OR分别为1.79(95%CI 1.26～3.12)(P<0.05)。PPXX与AD无明显负相关。表1 AD患者与健康老人ERαPvuⅡ、XbaⅠ基因型的分析与对照组比较：1)P<0.05，下表同

　　2.4 ERα基因多态性与AD的智能衰退相关性分析 由于入组前瞻性观察智能衰退状况的AD患者例数较少，故仅对与AD发病相关的ERα基因xx、Ppxx基因型进行分析。AD患者智能衰退程度在ERα基因xx、Ppxx基因型组分别与不含xx、Ppxx基因型组之间无显著性差异。结果显示ERа基因多态性与AD的智能衰退无明显相关性(表2、表3)。表2 AD患者与健康老人ERαPvuⅡ、XbaⅠ基因型的相互作用分析 表3 ERα基因多态性与AD的智能衰退相关性分析

　　3 讨 论

　　雌激素是调节人类的生长发育和衰老重要生物因子，雌激素在脑内的作用靶点是ER，对ApoE脑内mRNA表达的具有调节作用，对神经细胞突触的生长具有促进作用，其作用的效果可能受ER的多态性影响〔2，4，7，10〕。ER包括ERα、ERβ2种亚型,人类ERα基因位于6q2427〔1〕，包括8个外显子和7个内含子,长约140 kb。ERα基因第1内含子内距第2外显子上游约0.4 kb处发生的T/C转换及距该位点下游约50 bp处发生的A/G转换,产生ER基因PvuⅡ、XbaⅠ酶切多态性〔2，3〕。大量研究结果显示，男女AD患病率存在明显差异，女性患病率是男性的1.5～3倍〔5，6〕。女性绝经后，血浆内雌二醇和雌酮的浓度急剧下降，女性患AD的危险性比男性高，说明绝经后雌激素水平减低可能与AD有某种程度的联系〔6～9〕。近期国外研究发现，雌激素а受体的基因多态性与SAD的发病存在密切相关性〔2～4〕，Brandi等〔2〕发现SAD患者ERа基因的X或P基因型较对照组明显增高，ERа基因的XX或PP基因型者患AD的风险较无X或P基因型者平均高2.9倍。Monastero等〔3〕的研究揭示在欧洲高加索人群中ERа的xx基因多态性与SAD的发病密切相关，Porrello等〔4〕研究同样证实ERа的x或p基因多态性与SAD的发病密切相关。另一方面，有研究显示ERа的基因多态性与SAD的发病无相关性。可见ERа的基因多态性与SAD的相关性研究的结论存在明显差异。

　　本研究显示，健康老年人群ERа基因型分布分别为PP21.43、Pp48.57%、pp30.0%;XX15.71%、Xx37.14%、xx47.14%;p和x等位基因频率为53.57%和65.71%。其中以p、x基因位点居多，这与国内其他研究所揭示的汉族人群ERа的基因多态性分布相一致〔12，13〕。AD组Pp、xx型较对照组明显增加，而PP、XX型明显减少;经调整高血压病、糖尿病、高脂血症的影响因素后xx与AD发病明显正相关;Pp、PP、XX与AD无明显负相关;AD组等位基因x的频率明显增加。联合基因分析结果示:AD组Ppxx型较对照组明显增加，而PPXX型明显减少，Ppxx与AD发病明显相关，PPXX与AD无明显负相关。这一结果与Monastero〔3〕的研究相似，揭示xx基因型可能是中国汉族人群AD发病的危险因素。同时，本研究ERа基因多态性与AD的智能衰退无明显相关性。本研究与Brandi等〔2〕研究结果存在明显不同，考虑主要与健康对照组的选择标准不同和种族差异有关。另一方面，尽管ERа基因的xx、Ppxx型与AD的发病相关，但是，本研究显示，AD患者的智能水平的下降趋势与xx、Ppxx基因型无相关性，提示AD患者的智能衰退尚受其他因素的影响。

　　在ERа的基因多态性的相关性研究中，国内外研究者发现血脂和脂蛋白水平与ERа基因的多态性相关，雌激素а受体XbaⅠ基因多态性中XX、PP基因型与血脂和低密度脂蛋白水平升高相关，而与高血压和糖尿病无明显相关性〔11，12〕。在本研究中对照组虽然无明显高血压病和糖尿病，但存在轻度高脂血症占25%。本研究结果显示对照组的ERа基因的XX、PP基因型较AD组存在明显差异，但在调整高脂血症的影响因素后，两组之间的差异无明显统计意义，提示高脂血症可能与雌激素а受体XbaⅠ基因多态性中XX、PP基因型相关。

　　目前已发现与AD相关的遗传基因包括淀粉样蛋白前体蛋白、早老素1、早老素2的基因突变和载脂蛋白E等位基因4(ApoEε4),其中仅有ApoEε4是被国内外多个研究证实与SAD发病密切相关的高危因素〔14，15〕。Porrello等〔4〕进一步研究显示ERа的x基因多态性与ApoEε4对AD的发病存在相互作用，可见雌激素а受体XbaⅠ基因多态性与AD发病的关系密切。以往多数研究认为雌激素替代治疗(ERT)对降低AD发病风险和改善认知功能具有一定的作用〔7〕，近期的大样本研究揭示ERT对已患AD的绝经妇女不仅无治疗作用，而是加速认知功能恶化的现象 〔8，9〕。这些研究结果的相互矛盾，是否与ERа基因多态性有关，高选择性的雌激素受体激动剂是否可以改善痴呆患者的症状，这些问题有待进一步探索。

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