细胞周期相关基因在食管癌变中的表达及意义

　　作者：刘亮,郭建文,王静,刘江惠,左连富　　作者单位：河北医科大学第四医院肿瘤研究所流式细胞室，河北 石家庄 050011

　　【摘要】目的研究细胞周期调控因子细胞周期素25A (cell division cycle 25 A,CDC25A)、转化生长因子β(TGFβ)、Smad3基因在食管上皮癌变过程中的表达及其意义。方法 利用RTPCR方法检测44例同一个体的食管癌、食管不典型增生组织、食管正常黏膜组织中CDC25A、TGFβ、Smad3 mRNA的表达。结果 从食管正常黏膜组织到不典型增生组织和食管癌组织，CDC25A基因表达呈逐渐增高趋势，TGFβ、Smad3基因表达呈逐渐下降趋势，三者在食管癌组织和正常组织之间有显著差异(P<0.05)。低分化鳞癌中CDC25A基因表达显著高于中高分化鳞癌(P<0.05)，低分化鳞癌中TGFβ、Smad3基因表达显著低于中高分化鳞癌(P<0.05)。其表达量与年龄和性别无关(P>0.05)。结论 CDC25A、TGFβ、Smad3的表达失衡与食管癌的发生、发展有密切关系，在食管癌变早期即已出现，可以作为早期诊断的指标。

　　【Abstract】 Objective To study the expression and significance of cell cycle regulatory factor such as cell division cycle 25 A (CDC25A), transforming growth factorβ (TGFβ) and Smad3 in esophageal epithelial cancer. Methods The expressions of CDC25A, TGFβ and Smad3 mRNA of esophageal cancer, atypical hyperplasia and normal tissues from the same individual were measured by RTPCR. Results From esophageal normal to atypical hyperplasia and cancer tissues, the expression of CDC25A gene increased and the expressions of TGFβ and Smad3 gene decreased gradually. There were obvious differences between esophageal cancer and normal tissues in the expressions of CDC25A, TGFβ and Smad3 gene (P<0.05). The expression of CDC25A gene of low differentiation squamous carcinoma was higher than that of middle and high differentiation (P<0.05), and the expressions of TGFβ and Smad3 genes of low differences were lower than those of middle and high differentiation (P<0.05). The expressions of CDC25A, TGFβ and Smad3 genes had no relation with age and sex. Conclusions The imbalanced expressions of CDC25A, TGFβ and Smad3 genes have a close relation with the occurrence and development of esophageal cancer, and are occurred at the early period of canceration, which can be regarded as early diagnostic indicators.

　　【Key words】 Esophageal cancer; RTPCR; Flow cytometry; CDC25A; TGFβ

　　肿瘤的发生和发展从本质上是细胞增殖和凋亡之间失去平衡所致，即肿瘤细胞以无限增殖、分化受阻和细胞凋亡受抑制为特征，因此，抗肿瘤的研究热点集中在抑制增殖、诱导和调控肿瘤细胞凋亡方面。细胞周期素25A(CDC25A)对细胞从G1期向S期、G2期向M期过渡起着至关重要的作用，转化生长因子β(TGFβ)、Smad3调控着CDC25A的表达。有研究表明CDC25A在多种肿瘤中高表达〔1〕。迄今为止，国内外尚无CDC25A、TGFβ、Smad3基因在食管癌、癌旁及正常组织中表达的详细研究报道。为进一步明确食管上皮癌变的机制，为早期诊断和早期治疗提供理论基础，本实验采用RTPCR方法检测CDC25A、Smad3、TGFβ基因的表达，以探讨其在食管癌发生发展中的可能作用及临床病理意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 组织材料

　　44例原发性食管癌(高中分化鳞癌32例、低分化鳞癌12例)和同一个体癌旁食管黏膜(不典型增生Ⅰ级20例、Ⅱ级13例、Ⅲ级11例)及手术切缘正常食管黏膜均来自河北医科大学第四医院2005年8月～2006年8月食管癌手术切除标本。患者术前未经任何治疗。所有标本术中立刻取新鲜组织保存在液氮中。所有标本由两位有经验病理医师进行病理组织学诊断确认。患者中男24例，女20例，年龄43～74(平均57.48±13.48)岁。

　　1.2 主要试剂及仪器

　　RT试剂盒，美国Promega公司A3500;PCR酶混合物，赛百盛生物工程公司;引物，上海生工生物工程公司;Trizol试剂，美国Gibco BRL公司;PCR自动扩增仪，德国Eppendorf公司。

　　1.3 引物序列

　　CDC25A的引物：上游：5′CTGGAGGTGAAGAACAAC3′，下游：5′CTCATCAGACAAAGTGGC3′扩增片段456 bp;Smad3引物：上游：5′CGCTTGACTCACGCCTTCG3′，下游:5′TTCCTCTTGCGGCCACTT3′扩增产物长度422 bp;TGFβ引物：上游：5′CTCTGAACCCTGAAGC3′，下游:5′CTCAACTTACCATCCCT3′扩增产物长度440 bp;GAPDH引物：上游：5′CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT3′，下游：5′AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC3′扩增产物长度306 bp。

　　1.4 RTPCR检测方法

　　组织总RNA提取按Gibco BRL公司Trizol试剂说明书进行。反转录过程按美国Promega公司生产的A3500试剂说明书进行。取10×PCR缓冲液2 μl，MgCl2(25 mmol/L)2 μl，上下游特异引物(10 pmol/μl)各0.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)0.5 μl，cDNA 4 μl，TaqDNA聚合酶2 U，加去离子水至20 μl，充分混匀，短暂离心，94℃预变性5 min，94℃ 变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环后，72℃延伸5 min，置4℃保存。扩增产物6 μl EB染色在1.5%琼脂糖凝胶上以80 V电压直流电泳紫外光下成像并拍照，并用GelproAnalyzer3.1软件分析扩增产物的光密度(OD)，计算相对系数(相对系数=目的基因 OD值/GAPDH OD值)作为目的基因的相对表达量，从而对目的基因进行光密度半定量分析。实验重复3次。

　　1.5 统计方法

　　采用SPSS11.5统计学软件完成统计学处理，检测数据以x±s表示，组间比较采用配伍组方差分析、组间进一步两两比较采用LSD检验方法。

　　2 结 果

　　2.1 不同食管病变组织中CDC25A、Smad3和TGFβ mRNA的表达

　　从正常食管黏膜组到不典型增生组和食管癌组中CDC25A的mRNA表达量逐渐增高，TGFβ、Smad3的mRNA表达量逐渐降低。各基因表达量在三组间比较有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1。表1 不同病变食管组织中CDC25A、Smad3、TGFβ mRNA表达量(略)

　　2.2 食管癌中CDC25A、Smad3和TGFβmRNA的表达与不同临床参数之间的关系

　　各基因表达量与年龄、性别无关，与组织学分级程度相关。低分化鳞癌与高中分化鳞癌相比，CDC25A表达显著增高(P<0.05)，Smad3和TGFβ表达显著降低(P<0.05)。见表2。表2 RTPCR方法检测食管鳞状细胞癌中CDC25A、Smad3、TGFβ mRNA的表达与不同临床参数之间的关系(略)

　　2.3 CDC25A、Smad3和TGFβ mRNA的表达与食管不典型增生程度的关系

　　从不典型增生Ⅰ级到Ⅲ级CDC25A表达逐渐增高，Smad3和TGFβ表达逐渐降低，见表3。表3 CDC25A、Smad3、TGFβ mRNA在不同程度食管不典型增生组织中的表达(略)

　　3 讨 论

　　细胞周期紊乱及细胞周期调控因子分泌失衡是肿瘤细胞的典型特征。CDC25双特异磷酸酯酶是调控细胞周期的关键因子。目前人类细胞中已发现3种CDC25同型异构体，即CDC25A、B和C。其中CDC25A在多种肿瘤中如结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等均过度表达，并且与患者预后有关，因此，CDC25A被认为是一种癌基因。

　　CDC25A的作用机制是当它被磷酸化后即具有磷酸酶作用，可将与CyclinA结合的CDK1的Thr14/Tyr15去磷酸化，激活CDK1，使细胞周期从G1期进入S期〔2，3〕。CDC25A过度表达可导致细胞生长失控后恶性转化〔4〕。人体内CDC25A的表达水平主要通过泛素依赖的蛋白酶体降解途径加以调控〔5〕。而TGFβ介导的信号转导可促进靶蛋白的泛素化，Smad3则是这一过程的限速因子〔6～8〕。最新的研究显示，多种肿瘤细胞系高表达CDC25A是由于泛素依赖的蛋白酶体降解途径的功能异常，同时伴有TGFβ/Smad3信号转导蛋白表达异常〔9〕，提示TGFβ/Smad3信号转导通路有可能通过调节泛素依赖的蛋白酶体降解途径而影响CDC25A的表达水平〔10〕。本实验的结果表明：CDC25A在食管癌中的表达明显高于不典型增生组织及正常组织，而TGFβ、Smad3表达则呈上升趋势，说明在食管癌的发生发展中存在CDC25A、TGFβ、Smad3的表达失衡，提示CDC25A、TGFβ、Smad3系统的平衡失调可能是食管癌变过程中细胞周期发生紊乱的重要机制之一。食管癌组织中TGFβ、Smad3的表达下调从而导致CDC25A降解量减少，导致细胞周期紊乱，增加细胞周期从G1期向S期过渡而使细胞呈现增殖旺盛的特征。

　　本实验结果还发现，CDC25A、TGFβ、Smad3表达量与食管癌的分化程度有关。低分化鳞癌与高中分化鳞癌相比，CDC25A表达显著增高，TGFβ、Smad3表达显著降低。提示CDC25A、TGFβ、Smad3表达失衡与食管癌的恶性程度相关，CDC25A表达越高、TGFβ、Smad3表达越低食管癌的恶性程度越高。CDC25A表达越高、TGFβ、Smad3表达越低会使组织细胞呈现增殖旺盛的状态，这与恶性组织细胞增殖特点相一致。实验结果还发现，CDC25A、TGFβ、Smad3在不典型增生组织中即有表达，并与不典型增生程度有关。提示这些基因在食管早期癌变中就有表达，可以作为食管癌早期诊断的指标。

　　食管癌的发生发展可能有多条基因作用途径，目前研究推测，食管癌细胞可能通过下调TGFβ、Smad3的表达，而减少了对CDC25A表达的抑制，导致细胞周期发生紊乱，细胞产生失控性生长。

　　【参考文献】

　　1 Hernandez S,Bessa X,Bea S,et al.Differential expression of cdc25 cellcycleactivating phosphatases in human colorectal carcinoma〔J〕.Lab Invest,2001;81(4)：46573.

　　2 Broggini M,Buraggi G,Brenna A,et al.Cell cyclerelated phosphatases CDC25A and B expression correlates with survival in ovarian cancer patients〔J〕.Anticancer Res,2000;20(6C)：483540.

　　3 Evans KL.Overexpression of CDC25A associated with poor prognosis in breast cancer〔J〕.Mol Med Today,2000;6(12)：45965.

　　4 Draetta G,Eckstein J.Cdc25 protein phosphatases in cell proliferation〔J〕.Bioc Biop Acta,1997;1332(2)：5363.

　　5 Bernardi R，Liebermann DA，Hoffman B.CDC25A stability is controlled by the ubiquitinproteasome pathway during cell cycle progression and terminal differentiation〔J〕.Oncogene，2000;19(20)：244754.

　　6 Kretzschmar M,Massague J.SMADs:mediators and regulators of TGFbeta signaling〔J〕.Curr Opin Genet Dev，1998;8(1)：10311.

　　7 Fukuchi M，Nakajima M，Miyazaki T,et al.Lack of activated Smad2 in transforming growth factorβ signaling is an unfavorable prognostic factor in patients with esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.J Surg Oncol，2006;94(1)：516.

　　8 Shi Y，Massague J.Mechanisms of TGFbeta signaling from cell membrane to the nucleus〔J〕.Cell，2003;113(6)：685700.

　　9 Han SU，Kim HT，Seong DH,et al.Loss of the Smad3 expression increases susceptibility to tumorigenicity in human gastric cancer〔J〕. Oncogene，2004;23(7)：133341.

　　10 Ray D，Terao Y，Nimbalkar D,et al.Transforming growth factor β facilitates βTrCPmediated degradation of CDC25A in a Smad3dependent manner〔J〕.Mol Cell Biol，2005;25(8)：333847.