化疗对非小细胞肺癌患者血清抗Survivin抗体水平的临床研究
发表时间：2012-02-13 浏览次数：646次
作者：邹亚峰,王国臣 作者单位：063000 河北省唐山市，华北煤炭医学院附属医院胸外科
【摘要】目的 通过检测非小细胞肺癌患者化疗前后血清中抗Survivin抗体水平的变化观察治疗效果，指导临床治疗。方法 收集确诊的非小细胞肺癌患者260例，其中65例抗Survivin抗体阳性患者行化疗(化疗方案为吉西他滨第1、8天静脉点滴，1 000 mg/m2，顺铂第1～3天静脉点滴，30 mg/m2。21 d为1个周期，共4个周期)。全部标本的检测使用人抗Survivin抗体/生存蛋白(Surv Ab)酶联免疫分析试剂盒，酶联免疫吸附双抗体夹心法定量测定人血清中抗Survivin抗体的含量。结果 抗Survivin抗体在对照组中检测结果均为阴性，而在非小细胞肺癌组中阳性表达率51.5%(134/260)，其表达量明显高于对照组(P<0.05)。化疗组化疗前后Survivin抗体表达比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 抗Survivin抗体在健康人群中不表达，而在非小细胞肺癌中高表达，但在化疗第3～4周期迅速下降。
【关键词】 非小细胞肺癌,抗存活素抗体,存活素 酶联免疫吸附双抗体夹心法 化疗
【Abstract】 Objective To observe the changes of serum levels of antisurvivin antibody in patients with nonsmallcell lung cancer before and after chemotherapy in order to investigate the therapeutic effect and to guide clinical treatment.Methods 260 patients with nonsmallcell lung cancer were enrolled in the study including 158 males and 102 females，with a mean age of 59.14 years(age range：20～78yr)，and the serum samples of 140 cases of adenocarinoma and 120 cases of squamous cancer were cellected in whom 20 cases were at stage Ⅱ of lung cancer;100 cases were at stage ⅢA，30 cases were at stage ⅢB and 110 cases were at stage Ⅳ of pTNM status.The 68 healthy subjects were collected as controls，including 49 males and 19 females.Among 260 patients with nonsmallcell lung cancer，69 patients received surgical treatment and 65 patients received chemotherapy(Gemcitabine，GEM 1 000mg/m2 on day 1 and 8 and DDP 30 mg/m2 on day 1～3 every 21 days).All the serum samples were assayed with human antisurvivin antibody ELISA kits.The levels of antisurvivin antibody were detected by ELISA method.Results The antisurvivin antibody was negative in peripheral blood of healthy subjects，however，its expression rate was 51.5% in patients with nonsmallcell lung cancer(134/260，69 cases in operation group and 65 cases in chemotherapy group).There was a significant difference in the expression rate of survivin antibody between control group and the patient groups(P<0.05).There was a significant difference in the expression rate of survivin antibody of the patients before chemotherapy and after chemotherapy(P<0.05).Conclusion The antisurvivin antibody is not expressed in the peripheral blood of the healthy people，while it is expressed highly in patients with nonsmallcell lung cancer patients，however，which decreases sharply in the third cycle and the fourth cycle of chemotherapy.
【Key words】 nonsmall cell lung cancer;antisurvivin antibody;survivin;enzyme linked immunosorbent assay;chemotherapy
Survivin是新近发现的一种新的凋亡抑制蛋白(IAP)，1995年，Altier利用效应细胞蛋白酶受体1(EPR1)cDNA在人基因组织库中筛选克隆出Survivin基因。Survivin蛋白的组织分布特征有明显的细胞选择性，它表达于胚胎和发育的胎儿组织，不见于终末分化的正常成人组织(胸腺和生殖腺除外)，但在体内外的分化组织、人类大多数肿瘤组织内有Survivin蛋白的表达。该蛋白可被自身固有T细胞所识别，具有抗原性，血清中其抗体称为抗Survivin抗体。目前，国内外综合治疗对非小细胞肺癌患者血清抗Survivin抗体水平的临床研究甚少，多数为关于Survivin蛋白与临床疗效的观察研究，且结论多由统计肿瘤患者的生存期，或体外实验研究得出，鲜有探索临床治疗与非小细胞肺癌患者血清抗Survivin抗体之间的相互关系的临床观察研究。本实验用通过用ELISA法对非小细胞肺癌患者化疗前后血清中抗Survivin抗体的测定，检测抗存活素抗体变化，观察治疗效果，从而指导临床治疗。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2007年4月至2008年10月我院确诊的非小细胞肺癌患者260例(非小细胞肺癌组)，其中男158例，女102例;年龄20～78岁，平均年龄59.14岁;其中腺癌140例，鳞癌120例。TNM分期Ⅱ期20例，ⅢA期100例，ⅢB期30例，Ⅳ期110例。25～50岁的健康体检者68例(对照组)，男49例，女19例。所有患者采集清晨空腹静脉血2 ml，离心，3 000 r/min，10 min，取上清液，-20℃冻存。260例非小细胞肺癌患者血清标本(非小细胞肺癌组)，以及经ELISA法检测后证实为抗Survivin抗体阳性的65例化疗患者每周期化疗后1周采血经离心后的血清标本(化疗组)和对照组68例的血清标本。
1.2 化疗方案
吉西他滨第1、8天静脉点滴，1 000 mg/m2，顺铂第1～3天静脉点滴，30 mg/m2。21 d为1周期，共4个周期。
1.3 实验试剂
人抗Survivin抗体/生存蛋白(SurvAb)酶联免疫分析试剂盒。
1.4 检测方法
血清抗Survivin抗体浓度测定采用酶联免疫吸附双抗体夹心法，严格按说明书实验步骤操作，450 nm光波检测吸光度。
1.5 计算
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)，OD值为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标纸上绘出标准曲线根据样品的OD值，由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数;或用标准的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程，将样品的OD值代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
1.6 统计学分析
应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 对照组不同性别抗Survivin抗体检测结果
抗Survivin抗体男1.3857±0.0822，女1.4179±0.0884，对照组不同性别抗Survivin抗体表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2 对照组和非小细胞肺癌组
抗Survivin抗体测量结果比较 抗Survivin抗体对照组中检测结果均为阴性，非小细胞肺癌组中阳性134例，表达率51.5%，其表达量明显高于对照组(P<0.05)。见表1。表1 2组Survivin抗体检验结果比较(略)注：与对照组比较，*P<0.05
2.3 化疗组化疗前后抗Survivin抗体测量结果
化疗组化疗前与化疗1周期Survivin抗体表达两者比较差异无统计学意义(P>0.05)，4个周期化疗期间抗Survivin抗体表达，1周期与2周期比较差异有统计学意义(P<0.05)，2周期与3周期比较差异有统计学意义(P<0.05)。3周期与4周期比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。表2 化疗组化疗前后抗存活素抗体测量结果(略)注：与化疗1周期比较，*P<0.05;与化疗2周期比较，#P<0.05
3 讨论
Survivin是新近发现的一种新的凋亡抑制蛋白(IAP)，1995年，Altier利用效应细胞蛋白酶受体1(EPR1)cDNA在人基因组织库中筛选克隆出Survivin基因[1]，Survivin基因全长15kb，位于17q25，由分子大小为1.9kb的mRNA所编码，是一个143个氨基酸的蛋白，它不仅含有单一的杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列(BIR)功能区、而且没有环指结构[2]。Survivin与其他凋亡因子不同，除参与凋亡的控制外，还特异地在细胞周期G2/M期表达，通过与细胞有丝分裂纺锤体的微管结合，参与对细胞基因转录的调节。Survivin依赖细胞增殖信号介导而进入核内，与细胞周期调节子Cdk4结合，导致Cdk2/Cyclin的激活和Rb磷酸化，Survivin/Cdk4的形成使P21释放[3]，P21通过紧密结合于G1期和S期的蛋白激酶(cyclin D1Cdk4和Cyclin ECdk2)，抑制其活性，对细胞增殖停留在G1期具有重要的重用，P21的解离使Cdk4活化，细胞进入增殖周期，最终导致大量细胞无限制增殖。
Survivin蛋白的组织分布特征有明显的细胞选择性，它表达于胚胎和发育的胎儿组织，不见于终末分化的正常成人组织(胸腺和生殖腺除外)，但在体内外的分化组织、人类大多数肿瘤组织内有Survivin蛋白的表达[4]。该蛋白可被自身固有T细胞所识别，具有抗原性，血清中其抗体称为抗Survivin抗体。癌细胞的Survivin过表达可导致抗Survivin抗体和细胞毒性T淋巴细胞抗癌反应[5，6]。目前，Survivin的基因表达情况可以通过分子生物学、免疫组化、血清抗Survivin抗体等多种方法检测，但前两种方法由于操作复杂繁琐，不易在临床上推广，而血清学方法由于具有操作简单，重复性好，不需要蜡块等优点，在临床上已见报道。2000年 Rohayem等[6]首先报道了用ELISA法检测肺癌和结直肠癌患者血清中的抗Survivin抗体，其中肺癌患者51例，结直肠癌患者49例，在其实验中，肺癌患者抗Survivin 抗体阳性，阳性率为21.6%(11/51)，结直肠癌患者抗Survivin抗体阳性，阳性率为8.2%(4/49)。并且发现抗Survivin 抗体在肺癌患者中有相当高的流行率，令人感兴趣的是在肺癌的细胞株中Survivin的表达水平尤其高。因此Survivin 可以被认为是一种主要的肿瘤抗原[7]。国内董德琼等[8]报道用酶联免疫吸附试验检测非小细胞肺癌患者血清中的抗Survivin 抗体34例，抗Survivin抗体阳性率为32.5%(11/34)，高于21.6%的阳性率的报道，且有治疗后较治疗前有明显下降。以高于对照组均值2个标准差作为非小细胞肺癌抗Survivin抗体阳性的诊断标准。我们在本实验中，收集了260例非小细胞肺癌患者治疗前的血清，所有患者均符合世界卫生组织/国际肺癌学会(WTO/LASLA)肺和胸膜肿瘤组织学分类标准[9]，用酶联免疫吸附双抗体夹心法检测其血清中的抗Survivin抗体，其阳性率为51.5%(134/260，手术组69，化疗组65例)，高于以往报道，可能与我们所用的试剂有关。为了便于比较治疗前后抗Survivin抗体的变化，我们剔除了抗体阴性的非小细胞肺癌患者及未经治疗者，其中65例行化疗，吉西他滨+顺铂，4个周期。实验结果以高于对照组均值2个标准差作为非小细胞肺癌抗Survivin抗体阳性的诊断标准：1.3946+2×0.0846=1.56 U/ml。健康对照组全部阴性，Survivin在正常组织中不表达。这表明检测非小细胞肺癌患者血清中的抗Survivin抗体，用于肺恶性疾病的诊断及鉴别诊断具有一定的特异性。
在化疗组中，非小细胞肺癌患者65例，化疗前抗体水平2.4865±0.7149，化疗1周期后1周，抗体水平为2.4215±0.5357，化疗2周期后1周测抗体，抗体水平为1.9522 ±0.4370，抗Survivin抗体3周期后测Survivin抗体，抗体水平为1.6026±0.2838，抗Survivin抗体阴性24例，占36.8%(24/65)。 4周期后测Survivin抗体，抗体水平为1.4597 ±0.2561，由此可见，非小细胞肺癌患者抗Survivin抗体阳性患者，随着化疗周期的延长，其抗体水平逐步下降，考虑：(1)与化疗药杀灭肿瘤细胞，减小肿瘤负荷，减少血源性播散有关。(2)抗Survivin抗体阳性的非小细胞肺癌患者，随着化疗周期的延长，其抗体水平逐步下降，与化疗药的时间剂量相关。2006年的Pignon等[10]的LACE(肺癌含铂辅助化疗评估)荟萃分析，对5项随机对照试验，共4 584例患者，所有的荟萃分析显示：顺铂为主的辅助化疗显著延长了患者的生存期，获益的程度与肿瘤的期别相关，并首次确定了顺铂剂量的重要地位，其中剂量必须超过300 mg。化疗组中，65例非小细胞肺癌患者均经4个周期的化疗，其顺铂总剂量均大于300 mg。通过4个周期的化疗，该组化疗患者，抗Survivin抗体总的水平有所下降，说明抗Survivin抗体的高表达与Survivin高表达可导致细胞凋亡与细胞增殖失控具有一致性，可能是非小细胞肺癌细胞对化疗药物产生耐药进而恶性增殖的原因。Olie等[11]研究发现，利用Survivin 反义核酸技术，可使肿瘤细胞Survivin mRNA减少而caspase3活性增加，促进肿瘤细胞凋亡，并增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性。
【参考文献】
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2 Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.A novel antiapoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma.Nat Med，1997，3：917921.
3 Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fasmediated cell death.Oncogene，2000，19：13461353.
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6 Rohayem J，Diestelkoetter P，Weigle B.et al.Antibody response to the tumorassociated inhibitor of apoptosis protein survivin in cancer patients.Cancer Res，2000，60：18151817.
7 Tamm I，Wang Y，Sausville E，et al.IAPfamily protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas(CD95)，Bax，caspases，and anticancer drugs.Cancer Res，1998，58：53155320.
8 董德琼，杨渝浩.非小细胞肺癌患者血清抗Survivin抗体、P53抗体水平的研究.贵州医药，2005，29：969970.
9 钟雪云.肺和胸膜肿瘤的病理组织学新分类.中国肿瘤，2000，9：129130.
10 Pignon JP，Tribodt H，Scagliotti GV，et al.Lung Adjuvant Cisplatin Evaluation(LCAE)：a pooled analysis of five randomized clinical trials including 4584 patients.Proc Am Soc Clin Onocol，2006，18：s336.
11 Olie RA，SimoesWust AP，Baumann B，et al.A novel antisense oligonucleotide targeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemotherapy.Cancer Res，2000，60：28052810.
