MTA1和nm23H1与哈萨克族食管癌生物学行为的关系
发表时间：2011-11-08 浏览次数：532次
作者：陈艳,王洪江2,李卉3,庞作良2 作者单位：新疆医科大学1基础医学院生物化学与分子生物学教研室， 2附属肿瘤医院胸外科， 3基础医学院科研中心，4基础医学院形态中心;5 军区总医院检验科; 6新疆医科大学基础医学院组织胚胎学教研室, 新疆乌鲁木齐830011)
【摘要】目的探讨MTA1和nm23H1蛋白表达水平及其与哈萨克族食管癌生物学行为的关系。方法应用Western blot对20例哈萨克族食管癌标本中MTA1和nm23H1蛋白表达进行检测。结果MTA1在食管癌癌组织中的表达率为45%，但癌组织与相应正常组织表达量无明显差异;nm23H1在食管癌癌组织及正常组织中未表达的占50%，并且90%肿瘤至少侵及肌层，其中70%的肿瘤并伴有淋巴结转移。结论在哈萨克族食管癌的浸润、转移中MTA1可能不起主导作用，而nm23H1低表达表型可能有助于浸润和淋巴结转移，与生物学行为有关，可有望成为哈萨克族食管癌患者转移复发的参考指标。
【关键词】 食管癌,肿瘤转移相关基因1,nm23H1,哈萨克族
Abstract: ObjectiveTo investigate the expression significance of MTA1 and nm23H1 gene and the relationship between MTA1 and nm23H1 gene expressions of the effect of biological behavior in Hazak′s esophageal cancer. MethodsWestern blot was used to detect the expressions of MTA1 and nm23H1 protein among 20 Hazak′s esophageal cancer samples. ResultsThe positive rate of MTA1 proteins was 45% and there was no significant differences of expression between cancer tissues and normal tissues. But the negative expression of nm23H1 proteins reached to 50%, moreover, the rate of intramuscular infiltration was 90%, which 70% samples were accompanied by lymph node metastasis. ConclusionOur finding suggests that MTA1 expression may not play an important role in infiltration and lymph node metastasis in Hazak′s esophageal cancer. The low expression of nm23H1 protein may contribute to infiltration and lymph node metastasis in the biological behavior of Hazak′s esophageal cancer. And nm23H1 can be used as a prognostic marker for detection of recurrence and metastasis in patients with esophageal cancer.
Key words: esophageal cancer; metastasisassociated gene 1; nm23H1; Hazak
食管癌的预后较差，平均术后5年生存率仅为5%～10%。食管癌致死的主要原因之一是癌细胞从原发灶转移到邻近和远隔器官，因此临床上寻找新的判断预后指标是提高食管癌患者的生存率、降低死亡率的关键所在。肿瘤的侵袭转移是一个多步骤、多阶段的过程，其每一个阶段都受到许多基因(包括转移相关基因和转移抑制基因)的调控。转移相关基因的激活和(或)转移抑制基因的失活均可诱导肿瘤转移表型的产生，导致肿瘤的侵袭转移。肿瘤转移相关基因1(MTA1)和nm23H1基因就是具有代表性的肿瘤转移基因和肿瘤转移抑制基因。本研究对20例哈萨克族食管癌标本中的MTA1及nm23H1蛋白进行检测，旨在探讨其表达状态与哈萨克族食管癌生物学行为的关系，从而为食管癌患者的个性化治疗提供一些新的思路。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验标本与分期20例哈萨克族食管癌组织标本(癌组织及相应正常组织)均来自新疆医科大学附属肿瘤医院胸外科2007～2009年食管癌手术切除术中。所有组织标本取材标记后立即置于液氮中，然后放在-70℃冰箱中长期保存。临床病理分期根据术后病理检查结果，按照国际食管癌会议制定的TNM分期标准(1997年)：T1 期：肿瘤侵及粘膜层;T2 期：侵及肌层;T3期：侵及食管外膜;T4期：肿瘤侵及邻近器官。N0代表无区域淋巴结转移，N1代表有区域淋巴结转移。M0代表无远处器官转移，M1代表有远处器官转移。
1.1.2主要试剂山羊抗人多克隆抗体MTA1(c17)为美国Santa Cruz生物技术产品;小鼠抗人多克隆抗体antinm23(Ab1)为德国默克公司Calbiochem产品;兔抗山羊多克隆抗体IgG HRP，ECM Kit(兔IgG)均为武汉博士德生物工程有限公司产品;兔抗人多克隆抗体GAPDH为美国ProteinTech Group生物技术公司产品;辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;HybondTMC硝纤膜是美国Amersham生物技术公司产品;BCA 蛋白检测试剂盒德国默克公司Novage产品;阿尔梅医用X射线胶片购自乌鲁木齐市沙依巴克区伟业实验器材供应站;PMSF、Pepstatin A、Aprotinin、Leupeptin、HEPES、EGTA、NP40、SDS、Tris、EDTA、DTT、丽春红S均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.2方法
1.2.1提取组织蛋白取0.01～0.04 g组织加入10倍体积全细胞裂解液(50 mmol/L TrisHCl pH 7.4、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA、1% NP40、0.1%SDS、10%甘油、1 mmol/L PMSF、1 μg/ml Aprotinin、1 μg/ml Leupeptin、1 μg/ml Pepstatin A)，置匀浆器上进行匀浆，匀浆液冰上裂解30 min，4℃ 12 000 r/min离心5 min, 收集上清，BCA法测定蛋白质含量，-70℃分装冻存。
1.2.2免疫印迹蛋白质样品与5×SDS凝胶载样缓冲液(187.5 mmol/L TrisHCl pH 6.8、6%SDS、50%甘油、150 mmol/L DTT、0.03%溴酚蓝)混合，煮沸变性5 min;上样总蛋白为60 μg，12% SDSPAGE电泳3 h，30 V 4℃电转移过夜转至NC膜;丽春红S染色2 min以观察各电泳带蛋白质量是否一致;4℃封闭过夜(封闭液：5%脱脂奶粉+3%BSA，含0.05%Tween20);TBST洗膜30 min，分别加入用TBS稀释的一抗山羊抗人多克隆抗体MTA1(1∶50)、小鼠抗人多克隆抗体antinm23(1∶200)、兔抗人多克隆抗体GAPDH(1∶400)、4℃孵育8 h;TBST洗膜30 min，与相应结合有辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊、山羊抗小鼠及羊抗兔的IgG抗体(1∶5 000)室温孵育4 h，TBST洗膜30 min;加入ECM试剂，暗室曝光，显影，定影，对X胶片扫描保存。
2结果
2.1MTA1蛋白表达情况20例食管癌癌组织及其正常组织中MTA1蛋白的表达的有9例(图1)。食管癌癌组织中MTA1表达率为45%，但癌组织与相应正常组织相比，其表达量无明显差异。
2.2nm23H1蛋白表达情况nm23H1蛋白检测结果显示，在20例食管癌癌组织及正常组织中表达的有10例，其中癌组织表达高于正常组织的有5例，癌组织表达低于正常组织的有4例;而未表达的则有10例，达50%。
Western blot检测MTA1与nm23H1蛋白表达水平2.3nm23H1低表达状态与临床病理分期的关系 nm23H1在10例肿瘤组织及正常组织中未表达，结合临床病理分期，其中侵及肌层T2 期以上的为9例，9例中有区域淋巴结转移的有7例，结果表明90%肿瘤至少侵及肌层，其中70%的肿瘤伴有淋巴结转移(表1)。
3讨论肿瘤转移相关基因1 ( metastasisassociated gene 1，MTA1)是新近发现的一个肿瘤浸润转移侯选基因，位于人染色体14q32.3 , 基因全长为2.2 kb，编码一个含703个氨基酸残基的蛋白质mtal，分子量为79.4 kD，属于核小体重构和脱乙酰基复合物(NuRD)的组成成员之一，它通过促进组蛋白脱乙酰基，影响基因的转录和复制，与多种肿瘤组织，尤其是上皮源性恶性肿瘤组织的侵袭转移能力密切相关[1]。有关食管癌浸润转移的相关性研究中，国内外对MTA1进行了大量的研究。Toh等[2]运用定量RTPCR技术检测47例手术切除的食管鳞状细胞癌组织标本中MTA1mRNA的表达情况，有16例(34.0%)MTA1 mRNA呈过表达。2004年Toh等[3]用免疫组织化学检测70例食管鳞癌标本中MTA1蛋白的表达水平，结果显示标本中有30例MTA1蛋白过表达(N
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