硫化氢对大鼠肺缺血再灌注氧化损伤的影响

　　作者：殷亚俊,刘志勇　　作者单位：1.东南大学 临床医学院，江苏 南京 210009;2.东南大学附属中大医院 心胸外科，江苏 南京

　　【摘要】 目的 探讨硫化氢对大鼠肺缺血再灌注氧化损伤的影响。方法 以硫化氢钠(NaHS)作为硫化氢供体。50只健康SD大鼠，随机分成假手术组、肺缺血再灌注组及硫氢化钠(NaHS)组，后者进一步分为NaHS 10、20、30μmol•kg-13个剂量组;每组10只。NaHS组实验前5 d开始每天按体重分别腹腔注射不同剂量的NaHS,实验前15min再次给药;假手术组和肺缺血再灌注组同时同方法给予生理盐水1ml•kg-1。建立大鼠在体肺缺血再灌注模型，实验结束时左心房放血处死大鼠，观察肺组织病理改变，测定肺湿/干重(W/D)值及肺组织匀浆内丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)含量及超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性。结果 肺缺血再灌注组肺组织W/D值、MDA、MPO水平均较假手术组明显升高(P<0.01)，而NaHS组上述指标高于假手术组但低于肺缺血再灌注组(均P<0.05);肺缺血再灌注组肺组织SOD、GSHPx活性较假手术组明显降低(P<0.01)，NaHS组上述指标低于假手术组但明显高于肺缺血再灌注组(P<0.05或P<0.01)。上述指标在NaHS 3个剂量组间的差异无统计学意义。肺组织病理学检查结果显示，NaHS组肺缺血再灌注损伤减轻。结论 硫化氢具有一定的抗大鼠肺缺血再灌注氧化损伤的能力，其作用机制与清除氧自由基及增加内源性抗氧化酶活性有关。

　　【关键词】 肺缺血再灌注损伤,硫化氢,硫氢化钠,氧自由基,氧化损伤

　　Abstract:Objective To explore the impact of hydrogen sulfide(H2S) on oxidative damage in lung of rats after ischemiareperfusion.Methods We used sodium hydrosulfide(NaHS) as the donor of H2S.Fifty SD rats were randomly divided into sham group(n=10),lung ischemiareperfusion group(IR group,n=10) and IR+NaHS group,and the IR+NaHS group was divided into IR+NaHS 10μmol•kg-1 group(n=10),IR+NaHS 20 μmol•kg-1 group(n=10),IR+NaHS 30μmol•kg-1 group(n=10).Five days before the experiment,rats of IR+NaHS(10μmol•kg-1,20μmol•kg-1and 30μmol•kg-1) groups were pretreated(intraperitoneal injection) with different dose of NaHS according to the weight,and administration again 15 min before the experiment;sham group and IR group were pretreated(intraperitoneal injection) with normal saline(1ml•kg-1).An rat lung I/R model was built in vivo.At the end of the experiment,all rats were put to death after blood was collected from left atrium.We examined indices of lung injury:lung histological change,ratio of lung wet weight to dry weight (W/D),malondialdehyde(MDA) and myeloperoxidase(MPO) content,activities of superoxide dismutase(SOD) and glutathione peroxidase(GSHPx) in lung tissues.Results The W/D ratio of lung tissue,contents of MDA and MPO in lung tissue in the IR group and IR+NaHS groups were significantly higher than those in the sham group (P<0.05 or P<0.01),while the indices above in IR+NaHS groups were significantly lower than those in the IR group(P<0.05);The activities of SOD and GSHPx in lung tissue in the IR group and IR+NaHS groups were significantly lower than those in the sham group (P<0.05 or P<0.01),while the indices above in IR+NaHS groups were significantly higher than those in the IR group(P<0.05 or P<0.01).All the indices abovementioned had no statistical significance in three dose of IR+NaHS groups.The lung histological change also showed that preadministration of NaHS could relieve lung ischemiareperfusion injury.Conclusions These findings suggest that H2S has a certain ability of antioxidative damage in lung of rats after ischemiareperfusion.Its mechanism involves oxyradical elimination and increase the endogenous antioxidant enzyme activity.

　　Key words:lung ischemia reperfusion injury;hydrogen sulfide;sodium hydrosulfide;oxygen free radical;oxidative damage

　　肺缺血再灌注损伤(lung ischemia reperfusion injury,LIRI)通常发生于肺移植、肺血栓栓子切除术后、肺栓塞溶栓治疗及各种体外循环心脏直视术后，是术后早期导致呼吸功能障碍及死亡的重要原因。如何减轻缺血再灌注损伤一直是医学界研究的重点和难点。LIRI发生机制十分复杂，尚未完全阐明，目前研究认为,可能与氧自由基引起的氧化损伤、钙超载及中性粒细胞(PMN)引起的过度炎症反应等密切相关[1]，其中机体产生大量的超过机体清除能力的氧自由基(OFR)在肺缺血再灌注损伤的病程发展中起了主要作用[2]。

　　硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是近些年来继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后人们发现的一种新的内源性小气体信号分子。研究已证实,H2S能减轻心、肝、脑和肠等脏器的缺血再灌注损伤，但有关H2S在LIRI中的作用的研究报道尚少见。本实验以硫化氢(H2S)供体硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)作为预适应药物，建立大鼠在体LIRI模型，观察其对肺缺血再灌注氧化损伤的影响，初步探讨其作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　健康SD大鼠50只(东南大学医学院实验动物中心提供)，体重250～300 g，雌雄不拘;NaHS(美国Sigma公司);小动物呼吸机(Inspira ASVp型,美国HARVARD公司);丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHPx)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，余试剂均为国产分析纯产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验分组及模型建立 50只大鼠随机分成以下5组，假手术组、肺缺血再灌注组及NaHS组，后者进一步分为10、20、30 μmol•kg-13个剂量组;每组10只。NaHS组实验前5 d始每天按体重分别腹腔注射不同剂量的NaHS，实验前15 min再次给药;假手术组和缺血再灌注组同时同方法给与生理盐水1 ml•kg-1。

　　各组大鼠用1%戊巴比妥钠(40 mg•kg-1)腹腔注射麻醉，手术过程中可适量追加戊巴比妥钠，每次5 mg。颈部气管切开，插管接小动物呼吸机(调节呼吸频率70～80 次•min-1，潮气量10 ml•kg-1)。经胸骨右缘第3～5肋间开胸，撑开器暴露右肺组织，大鼠尾静脉注射肝素(1000 U•kg-1)，离断右肺下韧带，用手术刀柄轻轻翻开右肺，暴露并游离右肺门;假手术组不阻断右肺门，持续灌注165 min，其余各组在吸气末用无创伤血管夹阻断右肺门45 min后去除血管夹，右肺组织通气再灌注120 min[3]。实验结束后左房放血处死大鼠。

　　1.2.2 肺组织湿/干重(W/D)值测定 取右肺中叶部分组织，滤纸吸尽表面液体，电子天平称取湿重，后置入80℃的烤箱中，48 h后称取干重，两者之比为肺湿/干重值。

　　1.2.3 肺组织匀浆中MDA、SOD含量及GSHPx、MPO活性的测定 右肺下叶取部分组织-80℃保存，待所有动物实验结束后，将肺组织制成10%生理盐水匀浆，4℃ 下3000 r•min-1离心10min，取上清，考马斯亮蓝蛋白测定法检测肺组织匀浆液中蛋白浓度，按试剂盒操作说明，分别检测MDA、SOD含量及GSHPx、MPO活性。

　　1.2.4 病理学检查 右肺下叶剩余肺组织用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，苏木精伊红(HE)染色，光镜下观察肺组织形态学改变。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS16.0统计学软件进行统计学分析，实验数据以x-±s表示，对实验数据行方差分析和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 肺组织病理学改变

　　光镜下见：假手术组肺组织肺泡间隔未见增厚，无炎细胞浸润，肺泡腔内无渗出物(图1A);肺缺血再灌注组肺组织结构不清，肺泡腔内充满大量渗出物，部分有红细胞漏出及坏死脱落的上皮细胞，肺泡间隔破坏，伴有少量单核细胞浸润;NaHS 10μmol•kg-1组与肺缺血再灌注组相比，肺组织损伤减轻，肺泡腔渗出物基本消失，部分结构基本恢复正常，局灶性肺泡间隔略有增厚;NaHS 20μmol•kg-1组与肺缺血再灌注组相比，主要表现为肺泡腔渗出物基本消失，病变以局灶性肺不张为主;NaHS 30μmol•kg-1组与肺缺血再灌注组相比，肺组织损伤亦减轻，肺泡腔渗出物基本消失，可见局灶性肺不张及肺泡间隔增厚。

　　2.2 肺组织湿/干重(W/D)值

　　 各组大鼠肺组织W/D值比较与假手术组比较，*P<0.05,** P <0.01;与肺缺血再灌注组较，▲P<0.05

　　肺缺血再灌注组肺组织W/D值较假手术组显著升高(P<0.01)，NaHS各剂量组W/D值虽较假手术组有所升高(P<0.05)，但均明显低于肺缺血再灌注组(P<0.05);在3种NaHS剂量组间肺组织W/D值的差异无统计学意义。

　　2.3 缺血再灌注肺组织内MDA、MPO含量的测定

　　各组大鼠肺组织匀浆中MDA、MPO含量的比较与假手术组比较，*P<0.05,** P<0.01; 与肺缺血再灌注组比较，▲P<0.05

　　与假手术组相比，肺缺血再灌注组肺组织匀浆中MDA、MPO含量均显著升高(P<0.01);各NaHS干预组肺组织匀浆中MDA、MPO含量虽高于假手术组(P<0.05)，但明显低于肺缺血再灌注组(P<0.05);而在3种NaHS剂量组间MDA、MPO含量差异无统计学意义。

　　2.4 缺血再灌注肺组织内SOD、GSHPx活力的测定。 各组大鼠肺组织匀浆中SOD、GSHPx活力的比较与假手术组比较，*P<0.05,** P<0.01;与肺缺血再灌注组比较，▲P<0.05,▲▲P <0.01

　　肺缺血再灌注组肺组织匀浆中SOD活力较假手术组显著下降(P<0.01);NaHS各剂量组肺组织匀浆中SOD活力虽然较假手术组低(均P<0.05)，但明显高于肺缺血再灌注组(均P<0.05);与假手术组相比，肺缺血再灌注组及NaHS 30 μmol•kg-1组肺组织匀浆中GSHPx活力均显著下降(P<0.01)，另两种NaHS剂量组肺组织匀浆中GSHPx活力也较假手术组降低(均P<0.05);但是NaHS组肺组织匀浆中GSHPx活力均高于肺缺血再灌注组(P<0.05或P<0.01);SOD、GSHPx活力在NaHS 3种剂量组间的差异无统计学意义。

　　3 讨 论

　　H2S是一种无色、具有臭鸡蛋气味的有毒气体，是造成水源和空气污染的主要污染物之一，人体过量吸入可引起多脏器功能损害甚至死亡。长期以来人们对其研究主要限于毒性作用，直至上世纪90年代中期，人们研究发现人体内源性H2S对神经系统的发育及其功能、消化道和血管平滑肌张力等均具有重要的调节作用。目前认为，H2S是近年来继NO和CO之后人们发现的一种新的内源性小气体信号分子。内源性H2S主要是由含硫氨基酸(L半胱氨酸)经多种酶促反应产生，其限速酶主要包括：胱硫醚β合成酶(cystathionineβsynase，CBS)、胱硫醚γ裂解酶(cystathionineγsplitting enzyme，CSE)。CBS、CSE的表达具有组织特异性，心、肺组织中内源性H2S主要由CSE催化产生。H2S在体内以两种形式存在——未溶解的气体H2S(约占1/3)和HS-钠盐NaHS(约占2/3)。NaHS在体内可分解为Na+及HS-，后者与体内H+结合生成H2S，H2S和NaHS在体内形成动态平衡[4]。已有研究[57]表明,H2S在许多肺脏疾病的发病机制中起着重要的调控作用，诸如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺炎症性损伤及肺纤维化等。

　　LIRI可导致明显的生理、生化及组织学改变，包括肺血管阻力增加、氧合减弱、肺顺应性降低及肺毛细血管通透性增加等。肺组织W/D值是评价肺水含量及肺微血管损伤的常用指标。我们在实验中观察到，缺血再灌注后肺组织W/D值大大升高，NaHS干预后W/D值较肺缺血再灌注组明显降低(P<0.05);同时，肺组织病理切片结果表明,NaHS组肺组织水肿及炎症变化程度均较肺缺血再灌注组明显减轻。这些均提示H2S可降低缺血再灌注后肺组织血管通透性，对肺缺血再灌注损伤有一定的保护作用。

　　目前认为，氧自由基(OFR)是引起器官缺血再灌注损伤的主要发病因素，主要包括超氧阴离子(O-2•)、羟自由基(OH•)及其活性衍生物如过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)等[8]。在正常情况下，OFR引发的组织损伤可被内源性抗氧化物质所抑制。但在缺血再灌注条件下，组织OFR产生过多，而抗氧化系统受到破坏，氧化/抗氧化系统失衡，机体积聚的大量OFR可攻击细胞膜脂质中多不饱和脂肪酸、蛋白质及DNA等，使得脂质过氧化、蛋白质功能受损及DNA链破坏，最终导致了组织损伤和细胞死亡。肺缺血再灌注时OFR主要由中性粒细胞“呼吸爆发”产生[9]。肺组织细胞膜上含有大量多不饱和脂肪酸，在缺血再灌注时极易受到OFR攻击。MDA是最具代表性的脂质过氧化代谢终产物之一[10]。因此，其在肺组织中含量的高低是反映氧化损伤程度的重要标志。本实验结果显示，肺缺血再灌注组肺组织MDA含量较假手术组明显升高，表明LIRI时，体内OFR的产生与清除失衡，肺组织内OFR增加，导致细胞及细胞器膜结构与功能破坏，最终引起了肺水肿、出血等损害。而应用NaHS预处理后，MDA含量虽较假手术组升高，但其幅度明显低于肺缺血再灌注组。提示H2S具有抗氧化损伤能力，能减轻OFR所引起的膜脂质过氧化，保护生物膜结构与功能。在LIRI发生与发展过程中，中性粒细胞的聚集、激活起重要作用。中性粒细胞氧化应激后可产生特异性酶MPO，其活性的高低可反映中性粒细胞的浸润程度，Zanardo等[11]的研究结果表明，急性炎症时，内源性H2S具有下调致炎性细胞因子及细胞间黏附分子表达的作用，减轻白细胞的黏附与聚集。本实验中观察到，肺缺血再灌注组肺组织MPO活性较假手术组显著升高，各NaHS预处理组MPO活性虽然高于假手术组，但均明显低于肺缺血再灌注组。提示提前腹腔注射H2S供体NaHS可减轻缺血再灌注损伤肺组织中中性粒细胞的聚集与激活。

　　SOD是机体有效清除OFR的重要活性酶之一，其可特异性清除O-•2，保护细胞免受损伤，在一定程度上可反映机体抗氧化能力的大小。GSHPx几乎存在于机体的所有组织中,能特异性地催化还原性谷胱甘肽对H2O2的还原反应，对组织中产生的H2O2有较强的清除能力,可保护细胞膜免受过氧化物的刺激和损伤。我们的研究发现：肺缺血再灌注组SOD和GSHPx活性明显低于假手术组，NaHS各剂量组SOD和GSHPx活性虽低于假手术组(P<0.05或P<0.01)但均较高于肺缺血再灌注组(P<0.05或P<0.01)。CSE是GSH合酶的关键酶，有研究发现在缺血性疾病中CSE基因表达增强[12]。本实验结果提示，H2S可以提高机体内源性抗氧化酶系统的活性，增加清除OFR的能力，从而减轻LIRI。

　　综上所述，内源性小气体信号分子H2S具有提高大鼠机体抗肺缺血再灌注氧化损伤的能力，可能主要是通过直接或间接清除机体部分OFR和增加机体内多种内源性抗氧化酶活性等作用实现的;然而，更确切的机制有待于进一步的研究。

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