胸部肿瘤患者血清蛋白组学检测的临床应用

　　作者：郑慧禹,综述,戴天阳△,审校　　作者单位：泸州医学院附属医院心胸外科，四川 泸州 646000

　　【摘要】随着蛋白组学技术和生物信息技术的飞速发展，蛋白质芯片表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDITOFMS)技术应运而生，它为恶性肿瘤的早期诊断构造了一个新的技术平台，具有高通量、高效率、高灵敏度、低创伤等特点，可以快速准确地分析标本中的蛋白质组成，在基础医学研究、临床疾病诊断以及药物研发方面显示出广阔的应用前景及临床意义。本文就其技术原理和在胸部恶性肿瘤的早期诊断中的应用及发展前景做一综述。

　　【关键词】 胸部肿瘤,蛋白组学,SELDI TOF MS ,早期诊断

　　蛋白组学是对动态流动因子组合的研究，当健康细胞向肿瘤细胞转化时，就有蛋白质表达、修饰、种类、及表达部位的变化，从而影响细胞的功能，蛋白组学技术就是要准确的监测疾病过程中蛋白质的变化，探讨其变化是肿瘤蛋白组学研究的重要问题。目前国内外已有不少学者应用表面增强激光解析/电离飞行时间质谱仪(surface-enhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectra，SELDITOFMS)技术从血清中筛选卵巢癌[1]、前列腺癌[2]、胃癌[3]等肿瘤特异性标志物，并1建立起相应的诊断模型，如：人工神经网络模型、判别分析模型等，其检测的灵敏度和特异性均能达到80%～100%，对于胸部肿瘤蛋白组学也有一定的研究，现就胸部肿瘤患者血清特异蛋白的表达检测综述如下。

　　1 SELDITOFMS的检测原理

　　SELDITOFMS作为一种带电粒子的质量鉴定方法，它的工作原理是采用化学或生物学的方法在蛋白芯片载体表面制作点状芯池，每个芯池用探针修饰，形成化学表面芯片探针或生物表面芯片探针。使用时先将需要检测的含有蛋白质的标本，如血清、尿液、脑脊液等按一定程序前期处理，然后在每个芯池内加入待测样品，样品中的蛋白与特定的探针结合后，在原位洗去非特异性结合及未结合的物质，再加入能量吸收剂，保留在芯片上的蛋白与能量吸收剂形成混合结晶，即可直接进行质谱检测。质谱检测的原理是芯池中的分析物经激光脉冲辐射解析形成电荷离子，不同质荷比(M/Z)离子在仪器场中飞行的时间长短不同，质量越轻，相对所带电荷越多，其质荷比也就越小，飞行时间越短，检测器即可将其最先检测到，信号由高速的模拟数字转化器转化并记录，被测定的蛋白质以一系列峰的形式呈现，这些特异的峰可看成此类疾病的蛋白指纹。SELDITOFMS分析的蛋白峰的质谱图的横轴表示蛋白质类型，纵轴代表蛋白质的强度和丰度，进行定量测定。整个技术流程包括蛋白芯片载体的选择、探针的选择及固定、待测样品的前处理、芯片检测、计算机处理和结果分析等步骤。利用SELDITOFMS可发现过去无法分离检测的新的疾病蛋白质谱图，可以将患者血清中蛋白质成分的变化记录下来，绘制成蛋白质谱图，并显示样品中各种蛋白的分子量、含量等信息，从而鉴别癌症患者和非癌症患者的血清蛋白质组图谱。

　　2 胸部肿瘤血清检测的研究

　　2.1 食管癌的研究 随着蛋白质组学实验技术(蛋自质芯片技术，蛋白双向凝胶电泳技术)和计算机生物信息处理技术的迅速发展，Yasuharu Hayashida et al[4]利用SELDITOFMS对27例样本血清进行研究(实验组为15例治疗前病理学诊断为食管癌患者，对照组为12例正常人群)，以向量计算法构建蛋白质图谱诊断模型，将诊断模型对实验组以盲算法进行独立检测，发现共有859个蛋白质峰，其中一组高表达有4个质峰，M/Z分别为7420、9112、17123和12867，通过向量计算法能区分实验组和对照组，这组质峰对实验组进行验证，有93.3%(14/15)的食管癌患者被正确诊断。Wang LD et al[5]利用SELDITOFMS和WCX2对130例样本血清进行检测(包括63例具有正常食管上皮组织，40例具有食管基底细胞增生，27例食管上皮细胞发育不良，30例食管癌患者)，发现食管基底细胞增生组有一个有效蛋白峰值，质荷比(M/Z)为9306.61u;食管上皮细胞发育不良组有一个有效蛋白峰值，M/Z为13765.9u;食管癌组有两个有效蛋白峰值，M/Z分别为2942.15u和15953.4u。分别以此建立3个决策树诊断模型，在训练组对三种类型诊断的敏感度分别为57.5%(23/40)、88.8%(24/27)、96.6%(29/30)，在测试组对三种类型的敏感度分别为57.5%(23/40)、66.6%(18/27)、60.0%(18/30);在训练组对三种类型诊断的特异度分别为96.8%(61/63)、63.4%(40/63)、92.0%(58/63)，在测试组对三种类型诊断的特异度分别为95.2%(60/63)、71.4%(45/63)、84.1%(53/63)。Yu WF et al[6]等采用CM10蛋白芯片及SELDITOFMS技术对贲门癌患者进行研究发现，检测38例正常对照与34例贲门癌患者血清标本，在相对分子质量2000～20000范围内，共检测到135个蛋白质荷比峰，其中41个差异有统计学意义(P<0.01)，通过软件包运算，用其中3个质荷比峰(5643/45793、8570/82126、15940/1533、M/Z)建立了贲门癌血清蛋白指纹图诊断模型，其建立的诊断模型可以有效区分贲门癌和健康人，并且准确度可达93.06%，敏感度可达85.29%，特异度可达100%，阳性预测值可达100%。

　　张红蕾等[7]用金属亲和表面(IMAC3)芯片和表面增强激光解析/电离飞行时间质谱仪(SELDITOFMS)检测44例食管鳞癌患者、42例正常人血清的蛋白质质谱，用食管鳞癌患者与正常人质荷比为M9479.43的一种蛋白质建立的决策树分类模型，在学习模式下44例食管鳞癌患者中有43例被正确诊断，42例正常人有40例被诊断正常，诊断准确率为96.5%(83/86)，敏感性和特异性分别为97.7%(43/44)、95.2%(40/42);在检测模式下44例食管鳞癌患者中有42例被正确诊断，42例正常人中有40例被正确分组，敏感性和特异性分别为95.4%(42/44)、95.2%(40/42)。Liu CZ et al[8]收集68例食管鳞癌患者和44例正常对照的血清，其中建模型组90例(55例为食管鳞癌，35例为正常对照)，盲法筛选组22例(13例为食管鳞癌，9例为正常对照)。采用固定金属亲和表面芯片，经SELDITOFMS测定得到蛋白质谱，通过软件比较两组人群的血清蛋白质谱的差异，经生物信息学分析得到决策树模型并进行盲法验证。发现在质荷比(m/z)1.5～20ku范围内，共检测到78个有效蛋白峰，其中25个峰差异有统计学意义(P<0.001)。对建模型组的蛋白质谱数据，通过1000次随机抽样，得到1000个决策树，结合3倍交叉证实方法，构建了“食管鳞癌正常对照”分组诊断的20个决策树模型。用这20个决策树来对22个盲法筛选样本进行归类预测，预测正确的样本为18个，盲法验证的灵敏度为92.31%，特异度为66.67%。通过上述对食管癌患者的血清中蛋白改变的研究，可能寻找到与食管癌相关的特异血清蛋白标志物，这些特异标志物的发现将有助于提高食管癌早期诊断率，也能为在食管癌高发地区进行大规模人群普查提供一个简便、快速的和痛苦少的筛查方法。

　　2.2 支气管肺癌的研究 Zhukov TA et al[9]用质谱分析法对3523例肺癌和肺癌前病变病理细胞群的蛋白谱区别的研究发现，与正常细胞相比，肿瘤细胞在17KD～23KD质谱范围内有3个峰明显上调，17.3KD的峰在任何正常组织中都未检测到，而在非典型性腺瘤样增生细胞中表现为低水平升高。表明这些蛋白标志物可以用于肺癌高危人群的筛选和肺癌对化学抑制剂反应的监测。Xiao XY et al [10]采用了IMAC Cu和WCX2两种不同的蛋白质芯片，对28例非小细胞肺癌患者及12例正常人血清标本的蛋白质谱进行检测。发现了5个高度特异和敏感的肺癌生物标志蛋白，有4个标志物同时在IMAC Cu和WCX2两芯片上出现。非小细胞肺癌患者血清中有2个标志物上调，而3个标志物下调。单个标志物的敏感度为75.0%～96.4%，特异度为75.0%～100.0%。Yang[11]等将208例血清样本(包括158例肺癌患者和50例健康个体)随机分为训练组(Ⅰ/Ⅱ期肺癌11例，Ⅲ/Ⅳ期肺癌63例，健康对照20例)和盲试组(Ⅰ/Ⅱ期肺癌43例，Ⅲ/Ⅳ期肺癌41例，健康对照30例)。采用SELDITOFMS分析，将训练组检测到的11493、6429、8245、5335和2538等5个蛋白质峰作为标记，用于检测盲试组，显示诊断敏感性为86.9%，特异性为80.0%，阳性预测值达到92.4%。另外，SELDI标记模式在检测非小细胞性肺癌(NSCLC)时敏感性为91.4%，远高于对小细胞肺癌的检测，在检测I/Ⅱ期肺癌时的诊断敏感性为79.1%。A.Alzetani et al[12]利用SELDI，采用CM10和IMAC蛋白芯片，对170例血清标本进行研究(70例非小细胞肺癌患者、75例正常人群、25例肺癌术后患者)，并以Wilcoxon rank test的统计方法来检测不同表达的峰值。采用CM10芯片初步检测39例非小细胞肺癌患者、38例正常人群及17例术后患者后发现19个不同的峰值表达(P<0.01)，但没有足够证据能证明术后可以恢复到正常状态;采用IMAC芯片检测所有标本，发现40个有差别意义的峰值(P<0.01)。以此资料区分患者，其特异性与敏感性均高于75%，对于术后患者一些肿瘤相关峰值可恢复到正常状态。综上研究表明，SELDITOFMS技术可用于检测肺癌和癌前肺上皮细胞恶性蛋白信号，以筛选肺癌的高危人群。

　　2.3 乳腺癌的研究 对于乳腺癌的蛋白质组学研究已经比较成熟，LI等[13]用SELDITOFMS技术及配套蛋白质芯片，检测49例乳腺癌和37例非乳腺癌疾病患者的血清蛋白质指纹图谱，并运用SPSS 10.0软件判别分析处理数据和筛选标志物，建立了三个诊断模型。组合构建的诊断模型I包括6个蛋白质峰，质荷比分别为8611、16827、25711、28931、25485和2437，鉴别乳腺癌和非乳腺癌疾病的敏感性为81.6%，特异性为78.4%。组合的诊断模型Ⅱ也包括6个蛋白质峰，其质荷比分别为4470、10854、19193、3883、2011和7470，鉴别I期乳腺癌与非乳腺癌疾病的敏感性为80.0%，特异性为89.2%。组合的诊断模型Ⅲ包括5个蛋白质峰，其质荷比分别为2726、27014、2247、4477和19333，鉴别I期与Ⅱ～Ⅳ期乳腺癌的敏感性为91.2%，特异性为93.3%。胡跃等[14]利用表面加强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDIT0FMS)技术及其配套蛋白质芯片，对49例乳腺癌患者和33例健康人的血清蛋白质组图谱进行检测，结合人工神经网络软件建立诊断模型并进行验证。结果发现以全部253个差异表达蛋白质峰的数据构建完整诊断模型，以差异最大的4个峰的数据构建简化诊断模型。完整模型盲法预测的灵敏度和特异度分别为83.33%(15/18)和88.89%(8/9)，对早期和中晚期乳腺癌的检出率分别为90.00%(9/10)和75.00%(6/8);简化模型盲法预测的灵敏度和特异度分别为76.47%(13/17)和90.00%(9/10)，3例早期乳腺癌均被其准确检出100.00%(3/3)，对中晚期乳腺癌的检出率为71.43%(10/14)。两模型灵敏度、特异度两方面的差异无统计学意义(P>0.05)，对早期和中晚期乳腺癌患者的检出率均无显著性差异(P>0.05)。Streckfus等[15]检测乳腺癌患者及健康女性的唾液标本，发现质核比分别为18000、113000、170000、228000、287000的5个蛋白质峰在乳腺癌唾液样本中高表达，它们可能成为诊断乳腺癌的肿瘤标记物。

　　3 问题与展望

　　SELDITOFMS蛋白质组学检测用于临床上肿瘤的早期诊断还需解决以下问题：(1)芯片测试的标准化、重复性和质量保证;(2)如何提高上样量，降低样品中高丰度蛋白对低分子量和低丰度肿瘤标志的干扰;(3)经质谱检测的蛋白后续鉴定需要生物信息学技术平台的支持，尚需开发更先进的配套蛋白质芯片分析软件;(4)芯片的成本较高;(5)如何正确评价已发现的蛋白质生物标记的特异性是非常重要，必须证实这种标记物在不同性别、不同种族人群中的有效性，能够对高危险人群中的个体做出评价、区分等。这些问题不仅在某种程度上限制了该技术的发展，同时也是其能否从实验室走向临床的关键所在。尽管如此，因为蛋白质芯片技术是近年来兴起的的一种蛋白质组学研究的新方法，以质谱分析替代传统的免疫诊断也是一种新的肿瘤诊断模式，SELDITOFMS质谱蛋白质芯片结合二者的优势为寻找肿瘤标志物建立了一个良好的技术平台，目前也在多种肿瘤研究中取得了可喜的成果，这项技术因其快速、高灵敏性和特异性及可全自动化分析的特点，必将能成为胸部恶性肿瘤标志物筛选、早期检测、分级、疗效及预后判定、寻找药物治疗特异性靶目标的关键技术，在胸部恶性肿瘤的基础研究和临床应用中具有广阔的应用前景。

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