心脏跳动中二尖瓣置换术心肌细胞凋亡的临床研究

　　作者：李逢昌，黄健辉，何巍 作者单位：1.广西柳州市人民医院，广西医科大学第五附属医院心胸外科，广西，柳州，545001;2.广西医科大学附属第一医院心胸外科，广西，南宁，530021

　　【摘要】 目的 检测心脏跳动中二尖瓣置换术患者心肌细胞凋亡情况。方法 将同期30例风心二尖瓣膜疾病患者随机分为实验组(浅低温心脏跳动中施术组)与对照组(中低温传统停跳施术组)。分别于心肺转流术(CPB)前，停机时留取右心房肌标本，采用原位细胞凋亡检测试剂盒，扫描电镜检测心肌细胞的细胞凋亡情况。结果 与CPB前比较，对照组CPB后心房肌细胞凋亡指数明显升高(P<0.01);而实验组CPB前、后心肌细胞凋亡指数差异无显著性(P>0.05);CPB后，实验组心肌细胞凋亡指数较对照组明显降低(P<0.01)。结论 在心脏跳动中二尖瓣置换术心肌细胞的细胞凋亡指数明显低于传统停跳手术组，说明心脏跳动中施术对心肌细胞的缺血和再灌注损伤要比传统停跳手术小。

　　【关键词】 心内直视手术 肌细胞 心脏 心肌细胞凋亡 瓣膜置换术

　　A clinical study on cardiac myocyte apoptosis in beating heart mitral valve replacement

　　LI Feng-chang, HUANG Jian-hui, HE Wei

　　(1. Cardiac Surgery Department, the People's Hospital of Liuzhou City, the Fifth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Liuzhou, Guangxi 545001, China; 2. Cardiac Surgery Department, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning, Guangxi 530021, China)

　　Abstract: Objective To investigate the apoptosis of the cardiac myocyte in mitral valve replacement while heart beating. Methods 30 patients with rheumatic mitral valvular heart diseases were divided into two groups: 15 patients in experimental group (aorta unclamped and mild hypothermia) and 15 ones in control group (aorta cross-clamped and moderate hypothermia). Samples of the right atrial were obtained before and after cardiopulmonary bypass (CPB) and the myocyte apotosis were examed via TUNEL reagents boxes and scanning electron microscopy. Results Compared to pre-CPB, myocyte apoptosis in control group increased significantly after CPB (P<0.01), while those in the experimental group showed no significant differences before and after CPB (P>0.05). Compared with control group, myocyte apoptosis decreased significantly after CPB in experimental group(P<0.01). Conclusion The myocyte apoptosis in heart beating mitral valve replacement is apparently less than that while heart arrest, which indicates myocyte ischemia and reperfusion injury induced by heart beating surgery is less than that in traditional heart stop-beating.

　　Key words: open cardiac operation; myocytes, heart; cardiac myocyte apoptosis; mitral valve replacement

　　过去认为，细胞凋亡在不具备再生能力的细胞如成熟的心肌细胞、神经细胞中不再发生。但近些年的研究表明[1]，细胞凋亡同样存在于心肌细胞中，并且在心脏的生理、病理发展过程中起重要作用，被认为是心脏由代偿性变化向生理性、病理性变化发展的细胞学基础。对心肌细胞凋亡的研究，国外要比国内起步早，他们研究发现[2,3]，心肌细胞凋亡的原因主要是心肌的缺血和再灌注损伤引起。笔者于围术期间检测心肌细胞的凋亡情况，旨在进一步了解心脏跳动中施术与停跳手术这两种术式的心肌缺血和再灌注损伤程度，从而为完善围术期的心肌保护提供实验依据。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　选择30例同期行二尖瓣置换术的风心病患者，随机分为心脏跳动中施术组(实验组，n=16例)和传统中低温停跳手术组(对照组，n=14例)。两组患者性别、年龄、体重、心胸比例、心功能等情况比较差异无显著性，具有可比性(P均>0.05)，见表1。表1 两组患者一般情况比较(略)

　　1.2 手术方法

　　两组病人麻醉采用静脉芬太尼、维库溴铵加间断吸入1%～3%安氟醚，麻醉前常规应用糖皮质激素地塞米松20mg、抑肽酶[100万u，分心肺转流术(CPB)前、CPB中及CPB后30万、40万及30万u应用]。胸部正中切口，全身肝素化(3mg/kg)。对照组：常规建立体外循环，鼻咽温度降至(32±1℃)，阻断上下腔静脉，停止肺辅助呼吸。阻断升主动脉后在其根部连续灌注冷高钾停搏液1000ml(4℃，改良Thomas停跳液)，灌注压力为9.31kPa，灌注流量为250ml/min，心脏停止活动，ECG呈直线。整个心内操作在中低温CPB下进行(25～28℃)。心内操作每超过30min，且ECG有曲线活动，再次灌注冷高钾停搏液500ml即可。CPB流量为每次2.4～3L/m2，灌注压为7.98kPa。实验组：常规建立CPB，缓慢降温至32℃(鼻咽温)，充分左心引流，不阻断升主动脉，不使用高钾心脏停搏液，心脏保持空跳慢跳状态，整个心内操作在浅低温CPB(31～33℃)下进行。灌注流量为每次2.4～3.5L/m2，灌注压为7.98kPa。

　　1.3 标本采集

　　术中分别于CPB前和拔除上腔静脉插管时剪除部分未被钳夹或结扎损伤的右心耳全层组织约100mg，生理盐水冲洗后立即置入4%多聚甲醛中固定6h。

　　1.4 心肌细胞凋亡的检测

　　采用TUNEL方法，细胞凋亡检测试剂盒由武汉博士德公司提供，操作按照试剂盒说明进行。阳性结果判定：细胞核中呈紫蓝色，核浓缩或核质呈均匀的染色，染色质边聚者为凋亡细胞。每一标本随机选取10个高倍视野，计算细胞凋亡指数(凋亡细胞占细胞总数的百分比)。

　　1.5 统计学方法

　　实验数据以±s表示，经SPASS 11.0统计软件处理，组间及组内比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 一般情况比较

　　两组患者转机时间、手术时间的差异均无显著性(P>0.05)，术后均无死亡。

　　2.2 心肌细胞凋亡指数情况

　　两组患者CPB前后均存在细胞凋亡现象。与CPB前比较，对照组CPB后心房肌细胞凋亡指数明显升高(P<0.01)，而实验组CPB前后心房肌细胞凋亡指数变化不明显(P>0.05)，两组CPB后，对照组较实验组心肌细胞凋亡指数明显升高(P<0.01)，见表2。表2 两组CPB前后心房肌细胞凋亡指数比较 (略)

　　3 讨论

　　细胞凋亡(apoptosis)是细胞死亡的一种重要形式，即程序性细胞死亡。一般认为，它是由基因控制的、有序化的主动死亡过程，与细胞坏死不同，细胞凋亡不会引起炎症反应。国内外学者[2～5]在各自的动物实验研究中发现：经历心肌缺血-再灌注就会出现细胞凋亡，且凋亡的严重程度与再灌注前的缺血时间长短有关，缺血时间长的再灌注组凋亡率较高。提示凋亡的发生与缺血时间关系密切，而再灌注可加快细胞的凋亡。在心肌缺血一定的时间后，给予血流再灌注，诱导了心肌细胞凋亡的发生。这可能是由于再灌注后虽然心肌得到了氧的供应，但却增加了氧自由基的形成，也加重了钙离子的超载，从而触发了心肌细胞凋亡的始发环节及核酸内切酶激活途径[6～8]。也就是说，缺血时间是内因，再灌注是外因。同样，在人类心肌缺血再灌注过程中也存在心肌细胞凋亡。Raraste等[9]对8例确诊因心肌梗死而死亡者的心脏标本进行检测，8例中有6例进行过成功的溶栓治疗，表明经历过缺血再灌注损伤，结果发现所有急性心肌梗死的心肌细胞中均有典型的细胞凋亡的生化特征。还发现凋亡细胞大量出现在正常心肌与坏死心肌的交界处。因此可以认为急性心肌缺血后再灌注过程中，细胞凋亡参与了细胞死亡调节过程。

　　我们的研究发现，对照组CPB后，心肌细胞凋亡指数比CPB前明显升高差异有高度显著性(P<0.01)，而实验组中，心肌细胞凋亡指数虽有所升高，但差异无显著性(P>0.05)。出现这一结果，我们认为：浅低温心脏跳动中施术，不阻断升主动脉，不灌注高钾心脏停搏液，简化了手术过程，同时可以给心肌持续获得氧合血供，避免或减少了心肌缺血和再灌注损伤，心脏保持不做功的空跳慢跳状态，心肌耗氧显著降低，浅低温体外循环有效地保护了体外循环的非生理性循环状态，更接近于心脏正常生理状态[10]。总之，心脏跳动中施术，避免或减少了心肌缺血和再灌注，从而最大程度上减少了诱发心肌细胞凋亡的发生，可能是这一结果的原因。其深入的机制有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]Zhihe LI. Increased cardiomyocytes apoptosis during the transition to heart failure in the spontaneously hypertensive rat [J]. Am Physiol,1997,272:H2313-H2319.

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　　[3]Gottlieb RA, Burleson KO, Kloner RA, et al. Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes [J]. J Clin Invest,1994,94(4):1621-1628.

　　[4]刘旭,徐平.心肌缺血—再灌注损伤与细胞凋亡[J].中华实用中西医杂志,2005,18(18):981-983.

　　[5]陈寄梅,张镜方,林秋雄,等.未成熟心肌缺血一再灌注损伤与细胞凋亡[J].中山大学学报：医学科学版,2004,25(3S):92-93.

　　[6]Sharov VG. Increased expression of apoptosis associated P53 protein in cardiocytes of dogs with chronic heart failure [J]. Circulation, 1995,92(Suppl):5.

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　　[8]Oshimi Y, Miyazaki S. Fas antigen-mediated DNA fragmentation and apoptosis morphologic changes are regulated by elevated cytosolic Ca2+ level [J]. J Immunol,1995,154(2):599-609.

　　[9]Saraste A, Pulkki K, Kallajoki M, et al. Apoptosis in human acute myocardial infarction [J]. Circulation,1997,95(2):320-323.

　　[10]何巍，林辉，郑宝石，等.浅低温体外循环心脏跳动中施术对心脏保护的实验研究[J].中华心血管外科杂志，2001，17(2)：96-98.