针对caspase3基因的RNA抑制对缺血再灌注神经细胞的保护作用

　　作者：包晓群 王 畅1 李金英2 宋冬晶3 刘 斌3 王微微 孙学敏 杨 宏 作者单位：(吉林大学中日联谊医院神经内科，吉林 长春 130033)

　　【摘要】 目的 探讨针对caspase3基因的 RNA抑制对缺血再灌注(I/R)神经细胞凋亡的影响，为I/R神经细胞基因治疗的可行性提供依据。方法 NGF诱导PC12细胞为类神经细胞。细胞随机分为对照组、模型组、GFP siRNA组;caspase3 siRNA组。于制作模型前24 h进行转染。于造模后对caspase3及细胞凋亡率等指标进行检测。结果 (1)凋亡率：模型组细胞(48.30±12.15)明显高于对照组(5.00±1.08)，差异有显著性(P<0.01);caspase3 siRNA组(7.04±2.00)明显低于模型组(P<0.01)。(2)Caspase3阳性率：模型组模型组的caspase3阳性率〔(36.55±8.72)%〕明显高于对照组〔(10.25±2.50)%〕，差异有统计学意义(P<0.01);caspase3 siRNA 组caspase3阳性率〔(12.25±3.25)%〕明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。结论 针对caspase3的siRNA能有效地抑制细胞凋亡。对缺血再灌注神经细胞损伤有一定的保护作用。

　　【关键词】 缺血再灌注;RNA干扰;细胞凋亡

　　近年来研究表明，细胞凋亡在缺血再灌注(I/R)神经元迟发损伤病理机制中起重要作用细胞凋亡的发生是一个主动的细胞死亡过程,它依赖于某些生物大分子物质,而且细胞凋亡是由基因调控的。caspase3是公认的细胞凋亡执行者，其活化将最终导致细胞凋亡〔1～3〕。RNA干扰可通过降低促凋亡基因的表达而对细胞凋亡起到干预作用。本实验用模拟缺氧复氧法作用NGF诱导后的PC12细胞，体外模拟建立I/R神经细胞模型，用RNAi方法对caspase3基因表达进行抑制，从而观察该方法对I/R神经细胞凋亡的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养和诱导 PC12细胞细胞培养基为含100 U/ml氨苄青霉素、100 U/ml链霉素、5%胎牛血清的DMEM培养基，5% CO2 37℃培养，3 d换液1次。增殖为80%汇合成片的单层细胞时，弃培养液，DHanks液漂洗2次。胰酶液消化，吹打细胞至全部脱落。1 000 r/min离心5 min，弃上清。加冻存液，轻悬细胞，加入冻存管，-70℃ 4 h，-196℃ 液氮保存。取出液氮中冻存细胞， 37℃水浴中摇动，快速复温，后离心， PBS洗液1 000 r/min震荡漂洗离心3次，弃上清，加入含5%胎牛血清的DMEM/F12培养基，5% CO2培养箱中37℃培养。2 d传代1次。成熟的PC12细胞接种于到含有50 ng/ml(约2 nmol/L)NGF的完全DMEM培养液中，使细胞密度达到(2.5～10)×104/cm2，每2～3 d换液1次。约1 w左右形成神经纤维，并且持续培养10 d，成为类神经细胞。

　　1.2 实验分组及转染 将细胞分为完全培养液对照组、模型组、GFP siRNA(绿色荧光蛋白基因干扰) RNA 组;caspase3 siRNA(caspase3基因干扰) RNA 组。

　　细胞转染：试剂由大连宝生物公司提供。将细胞接种于24孔培养板，48 h后细胞融合达46%～60%进行转染。每组设10个样本，转染24 h后，模型制造。

　　1.3 建立缺血再灌注的体外模型 根据Goldberg的方法建立体外缺血再灌注模型。弃培养液，加入等量的平衡盐溶液 (116 nmol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，0.8 mmol/L MgSO4，1 nmol/L NaH2PO4，0.9 nmol/L CaCl2和酚红 10 mg/L)。将培养细胞放入通有5%CO2和95%N2的 37℃培养箱中培养90 min后，把平衡盐溶液换为完全培养液。正常培养6 h进行Fas、 caspase3表达检测。24 h进行细胞凋亡相关检测。

　　1.4 caspase3 siRNA序列 前向：5′GATCCCGTACCACTTGACATTATCGTTCTTGATATCCGGAACGATAATGTCAAGTGGT

　　ATTTTTTCCAAA3′，反向：5′AGCTTTTGGAAAAAATACCACTTGACATTATCGTTCTCTCTTGAAGAACGATAATGTCAAGTGGTA

　　CGG3′(试剂购自大连宝生物公司)。

　　1.5 TUNEL法检测细胞凋亡 脱氧核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记法(TUNEL) 用细胞凋亡试剂盒(罗氏公司)。细胞用40 g/L多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、切片。步骤按细胞凋亡试剂盒说明书进行。结果判断：细胞核被染成棕黄色为阳性。 每张切片在400倍高倍视野下随机取20个视野，计数阳性细胞数。

　　1.6 流式细胞仪(FCM)分析 消化后收集细胞，1 000 r/min离心10 min，用冷PBS洗涤2次，去上清，沉淀中加入70%冷乙醇固定，于4℃中保存。1 000 r/min加in离心10 min，去上清，PBS(pH7.4)漂洗沉淀2次，1 000 r/min离心10分钟，去上清。加50 μl RNase(1 mg/ml)后置37℃水浴30 min。加PI(250 μg/ml)至终浓度50 μg/ml，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，加入5 μl Annexin VFITC和5 μl PI染料，轻轻振荡、混匀，避光室温下孵育15 min，加入400 μl染色缓冲液，流式细胞仪分析。

　　1.7 统计学方法 计量资料描述采用x±s，用SPSS12.0对数据进行统计学处理。

　　2 结 果

　　2.1 TUNEL染色结果 TUNEL染色显示凋亡的细胞核内有分布均匀的深蓝色颗粒，体积等于或小于正常胞核，凋亡细胞呈孤立、散在分布。再灌注后细胞凋亡数明显增加。对照组细胞凋亡数为(3.20±0.90) /视野，模型组为(90.80±30.25)/视野，两组间差异有统计学意义(P<0.01)，表明缺血再灌注可使神经细胞凋亡显著增加。GFP siRNA组为(92.15±30.45)/视野，与模型组相比，无显著差异。caspase3 siRNA组细胞凋亡数为(42.30±10.15)/视野，较模型组的神经细胞凋亡数明显减少(P<0.01)，提示抑制Caspase3可明显抑制Aβ沉积所致的神经细胞凋亡。

　　2.2 各组细胞凋亡率 对照组的细胞凋亡率为(5.00±1.08)%，模型组为(48.30±12.15)%，Caspase3 siRNA组为(7.04±2.00)%，GFP siRNA组为(39.85±9.60)%。Caspase3 siRNA处理组与对照组、GFP siRNA 组的细胞凋亡指数相比有统计学意义(P<0.01)。而GFP siRNA组和对照组细胞凋亡指数相比无统计学意义(P>0.05)。

　　2.3 各组caspase3阳性率 模型组的caspase3阳性率〔(36.55±8.72)%〕明显高于对照组〔(10.25±2.50)%〕(P<0.01)。GFP siRNA 组caspase3阳性率〔(32.16±6.11)%〕明显低于模型组(P<0.01)，与模型组相比，无显著性差异。caspase3 siRNA 处理组caspase3阳性率〔(12.25±3.25)%〕明显低于对照组、GFP siRNA组差异有统计学意义(P<0.01)。

　　3 讨 论

　　细胞凋亡信号通道是一个复杂的网络系统,受细胞内外多种因素调节,凋亡是由基因调控的，凋亡基因通常分为两大类，即抗凋亡基因和促凋亡基因。caspase家族是最常见的促凋亡基因，其中caspase3处于caspase家族级联反应的底端，是凋亡执行者。caspase3蛋白的大量表达预示着凋亡即将发生。理论上，如能有效抑制caspase3基因及其蛋白的表达，将有效干预细胞凋亡。

　　RNAi具有高度的序列特异性和高效性〔4〕，是一种高度进化得以保存的机制,出现在多种真核细胞如:酵母、无脊椎动物、植物和脊椎动物〔5〕。利用RNA干扰(RNAi)技术，可以高效、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，RNA干扰诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，使凋亡信号通路上的蛋白质基因在转录后水平沉默，是人为实现调节凋亡信号最有效的策略之一。凋亡信号通路可以在几个关键部位被有效地抑制。目前，已有文献报道在调节细胞凋亡过程研究中，针对caspase3〔6〕，caspase8〔7〕或Fas〔8，9〕等的siRNA发挥了有效作用。

　　本实验用NGF诱导PC12细胞为类神经细胞，设计并构建针对caspase3基因的si RNA质粒，转染经NGF处理的PC12细胞，然后建立模拟缺氧复氧模型，最终得到了明显地抑制了细胞凋亡的有效结果。本实验中，模型组细胞凋亡率及caspase3阳性率均明显高于对照组，caspase3 siRNA组caspase3阳性率及细胞凋亡率明显低于模型组。而GFP siRNA组样本各项参数与模型组相比均无明显差异。提示针对caspase3的RNA抑制能通过显著降低细胞内caspase3蛋白表达水平来降低细胞凋亡率，从而起到神经细胞保护作用。

　　【参考文献】

　　1 Chen M，Wang J.Initiator caspases in apoptosis signaling〔J〕.Pathways Apoptosis,2002;7:3139.

　　2 White E.Life,death and the pursuit of apoptosis〔J〕.Gene Dev,1996;10:1.

　　3 Fire A，Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans〔J〕.Nature，1998;391(6669)：80611.

　　4 Thakur A.RNA interference revolution〔J〕.Mol Biol Genetics，2003; 6(1):3949.

　　5 Hannon GJ.RNA interference〔J〕.Nature,2002;418:24451.

　　6 Wurzer WJ，Planz O，Ehrhardt C,et al.Caspase3 activation is essential for efficient influencenza virus propagation〔J〕.EMBO J,2003;2(11)：271728.

　　7 Zender L,Hutker S,Liedtke C,et al.Caspase8 small interfering RNA prevents acute liver failure in mice〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003;100:7797802.

　　8 Song E,Lee SK,Wang J,et al.RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis〔J〕.Nat Med，2003;9:34751.

　　9 Wang J,Li W,Min J,et al.Fas siRNA reduces apoptotic cell death of allogeneictransplanted hepatocytes in mouse pleen〔J〕.Transplant Proc，2003;35(4)：15945.