向内皮细胞分化的骨髓间充质干细胞体外三维构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

　　作者：姚祖武， 陈发林， 韩 涛 作者单位：福建省立医院 心外科、福建省心血管病研究所 外科，福州 350001

　　【摘要】 目的 以绵羊骨髓间充质干细胞在体外向内皮细胞诱导分化(MSCECs)作为种子细胞，去细胞猪主动脉瓣为支架，体外三维构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)。 方法 羊骨髓穿刺液，以Percoll梯度分离液离心法获取骨髓间充质干细胞(MSCs)，在内皮细胞诱导分化液中体外培养、扩增，鉴定;以酶消化法制备去细胞猪主动脉瓣叶支架，将体外培养扩增的诱导分化后的MSCs种植于支架上，体外三维培养，构建组织工程心脏瓣膜，研究细胞功能及组织学结构。 结果 MSCECs为梭形的成纤维细胞状形态,呈网格状排列;αSMA、Vimentin、CD31及Ⅷ因子细胞免疫染色阳性，培养上清液NO及ET1分别为(165.6±8.9)μmol/L及(50.6±5.6)ng/L，其中NO值明显高于未诱导组(P<0.05),猪去细胞瓣膜支架去细胞完全，弹力纤维及胶原纤维保持完整;诱导分化的MSCs在支架上生长良好，形成完整的细胞层。 结论 MSCs在体外向内皮细胞诱导分化后已初步具有内皮细胞功能,在去细胞猪主动脉瓣膜支架上生长良好,可以在体外初步构建TEHV。

　　【关键词】 内皮细胞; 骨髓细胞; 间充质干细胞; 生物假体; 心脏瓣膜，人工; 组织工程; 绵羊

　　心脏瓣膜置换手术已经成为终末期心脏瓣膜疾病的主要治疗手段，但目前临床上广泛应用的机械瓣及生物瓣膜远未达到理想程度，而组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)为人工瓣膜的研制提供了一种新的思路，正成为瓣膜外科领域的研究热点。目前国内外研究主要集中于种子细胞来源及支架选择上，其中以正常动脉内皮细胞及骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)研究为著，但动脉内皮细胞创伤大，需牺牲功能血管为代价，而MSCs取材方便，但内皮细胞功能不足，构建的TEHV整体功能尚有欠缺;虽然国内外大量研究均以人工材料为支架来源，但材料科学目前现状尚不能提供一种满意的符合TEHV要求的支架[13]。本研究以绵羊骨髓间充质干细胞体外向内皮细胞诱导分化后(bone mesenchymal stem cells induced to differentiate to endothelial cells，MSCECs)作为种子细胞，去细胞猪主动脉瓣膜为支架，体外三维构建TEHV,为TEHV的进一步动物体内实验研究奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 DMEM培养基，胎牛血清，0.05% Trypsin0.02% EDTA (美国Gibco公司), Olympus倒置相差显微镜(IX70型，日本Olympus公司),Ⅷ因子抗体,αSMA抗体,CD31抗体(美国Sigma公司),Vimentin抗体(美国Neomarker公司),一氧化氮(NO)药盒(晶美生物工程北京有限公司),内皮素(ET1)放射免疫药盒(解放军总医院科技开发中心放射免疫所),纤维连接蛋白(Fibronectin,Fn),内皮细胞生长因子(ECGF)，血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(美国Sigma公司)。

　　1.2 MSCs的分离 无菌下在绵羊髂前上棘处行骨髓穿刺，抽出10 mL左右骨髓，以DMEM液稀释1～2倍后，1 500 r/min离心10 min，弃含有脂肪及血小板的上清，再以等量的DMEM液重悬血细胞,沿管壁缓慢加入含10 mL密度为1.073 g/mL的Percoll梯度离心液的离心管内,用水平离心机以2 000 r/min离心30 min，吸取上中层之间的乳白色单个细胞层移入另一离心管中，并以>5倍的DMEM液稀释混匀后，2 000 r/min离心10 min，弃上清，加入少量的DMEM液制成细胞悬液，获取MSCs悬液。

　　1.3 MSCECs培养及体外扩增 将上述获取的MSCs悬液以2×105 cm-2底面积接种于培养瓶中,加入内皮细胞诱导分化培养液(含10%胎牛血清的DMEM液，VEGF 10 ng/mL，ECGF 10 ng/mL，bFGF 10 ng/mL，肝素50 IU/mL),置于体积分数为0.05、37 ℃的CO2饱和湿度恒温孵箱中培养，48 h后换液，以后每3天换液1次，当细胞达到80%～90%融合时以0.05% Trypsin+0.02% EDTA消化传代，取第2代细胞进行鉴定，第4代以后用于研究构建TEHV。

　　1.4 MSCECs的表型鉴定及细胞功能测定 将第2代MSCECs以每孔2×105接种于预置盖玻片的6孔板中，加入培养液1 mL，24 h后取出盖玻片,PBS液冲洗，甲醇固定20 min，常规免疫组化方法，加入αSMA抗体、Vimentin抗体、CD31抗体、Ⅷ因子抗体，采用EnVision二步法染色。上述细胞培养上清液置入-70 ℃中保存，以备测定其分泌的NO及ET1水平，测定方法参照药盒说明书操作。

　　1.5 MSCECs生长曲线测定 取生长状态良好的第3代细胞，消化制备单细胞悬液，计数，调整细胞密度为每孔5×l03，接种于96孔培养板，每个时相细胞接种3孔，每孔200 μL细胞悬液，置于培养箱培养。从第2天起，连续9 d,每天固定时间取3孔，以0.05% Trypsin+0.02% EDTA消化后置于显微镜下计数，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。

　　1.6 MSCECs的超微结构研究 取75 cm×75 cm培养瓶中90%融合的MSCECs，PBS漂洗，常规以0.05% Trypsin+0.02% EDTA消化，离心后4%多聚甲醛固定送透射电镜检测。

　　1.7 瓣膜支架的制备及预处理 将新鲜无菌猪主动脉瓣(含部分升主动脉及瓣下组织)加入0.05% Trypsin+0.02% EDTA液中于37 ℃下持续振荡24 h，PBS液反复振荡冲洗残余胰酶后制备去细胞猪主动脉瓣支架,取一支架行HE染色及弹力纤维及胶原纤维染色(VB染色)研究去细胞效果及弹力纤维，胶原纤维的完整性;制备的其余支架置入液氮中保存备用。本研究中支架以 50 μg/mL的Fn溶液完全浸没，室温下放置1 h预处理后用于构建TEHV。

　　1.8 TEHV体外构建方法 以多次沉淀法细胞支架接种技术将MSCECs以2×105 cm2种植密度,间隔24 h 3次接种于以Fn预处理过的去细胞猪主动脉瓣膜支架双侧内膜面上,然后静态培养7 d构建TEHV。

　　1.9 构建的TEHV瓣叶的组织学研究 将体外构建的TEHV瓣叶,分别以福尔马林及4%多聚甲醛行HE染色，免疫组织化学测定及扫描电镜检查。

　　2 结 果

　　2.1 MSCECs的体外培养、扩增及形态学特点 原代培养接种2～4 h后细胞开始贴壁，2～3 d就可见一些集落形成，10～14 d融合>90%,呈松散的网格状排列。MSCECs基本上为梭形的成纤维细胞状形态。传代培养后的细胞不再以成集落的方式生长，而是均匀分布生长，1∶3传代后一般5～7 d即可融合>90%，其超微结构显示，MSCECs核/质比例大，细胞质内细胞器不发达，表现出干细胞的特点，但胞质内分泌小泡增多，中间丝过度表达，可见内皮细胞特征性的WeiblePalade(WP)小体(图1)。其生长曲线见图2。

　　A：倒置相差显微镜下形态，梭形的成纤维细胞状均匀分布生长( ×200);B：透射电镜下形态，核/质比例大，细胞质内分泌小泡增多，箭头处WP小体( ×30 000).

　　2.2 MSCECs的表型鉴定及细胞功能测定 细胞免疫化学显示αSMA及Vimentin染色阳性，同时CD31及Ⅷ因子染色亦为阳性(图3);细胞培养上清液NO及 ET1分别为(165.6±8.9)μmol/L及(50.6±5.6)ng/L，同时以MSCs为对照组，同样条件下测定NO及ET1分别为(102.1±5.0)μmol/L及(42.0±7.8)ng/L;2组比较，MSCECs组中NO明显高于MSCs组(P<0.05),ET1无明显差异。

　　2.3 去细胞猪主动脉瓣支架的组织学检查 猪主动脉瓣叶,主动脉内膜面及瓣下心内膜的内皮细胞及间质细胞去除完全;弹力纤维及胶原纤维结构保留完好(图3A,B);扫描电镜结果示:去细胞瓣叶表面胶原纤维束排列完整,保存良好,瓣叶表面无内皮细胞附着(图3C)。

　　2.4 构建的TEHV的形态学检查 HE染色：MSCECs在支架上表面形成连续的细胞层，支架基质中未见细胞生长，免疫组织化学结果示：αSMA及Ⅷ因子染色阳性(图4)。扫描电镜结果示：瓣膜表面细胞扁平,细胞间隙较大，细胞排列有一定极性(图5)。

　　A：主动脉内膜面及瓣下心内膜的内皮细胞及间质细胞去除完全(HE染色，×100);B：弹力纤维及胶原纤维结构保留完好(VB染色，×100);C：去细胞瓣叶表面胶原纤维束排列完整,保存良好,瓣叶表面无内皮细胞附着(扫描电镜，×2 000);D：肉眼观察，主动脉瓣支架保持了主动脉根部的完整结构(三维去细胞支架).

　　A：支架上表面形成连续的细胞层,支架基质中未见细胞生长(HE染色，×100);B：Ⅷ因子免疫组织化学染色(×400);C：αSMA免疫组织化学染色(×200);D：瓣膜表面细胞扁平,细胞间隙较大，细胞排列有一定极性(扫描电镜，×2 000).

　　3 讨 论

　　种子细胞的选择是TEHV研究的首要环节，既往国内外研究主要选择血管内皮细胞或MSCs为种子细胞构建TEHV[13]，但理想的TEHV种子细胞来源除了应该具有良好的血管内皮细胞功能外,还应取材方便,体外扩增能力强,且对机体的创伤小。动脉血管内皮细胞与瓣膜内皮细胞有良好的同源性，但需牺牲一条功能血管为代价;而MSCs尽管取材方便、创伤小，但因其为未分化干细胞，且自然分化方向为肌成纤维细胞[4]，内皮细胞功能不足。故本研究选择动物MSCs在体外诱导分化为内皮细胞后构建TEHV，以弥补上述两类细胞之不足。

　　本研究结果显示，MSCs体外生长能力旺盛，细胞培养数量在短期内可以满足TEHV体外构建的要求，在含有VEGF、ECGF及bFGF的内皮细胞培养液中可以在体外成功诱导向血管内皮细胞分化，分化后细胞(MSCECs)虽然在形态上与内皮细胞有差别，但已开始表达内皮细胞特异性Ⅷ因子。瓣膜内皮细胞不仅具有屏障作用，还有内分泌功能，对预防表面血栓形成及损伤的修复，继而延长TEHV的耐久性有重要意义[5],而NO及ET1作为鉴定内皮细胞功能的常用的指标已被广泛接受。本研究结果表明，虽然ET1无明显差别，MSCECs的NO值明显高于MSCs，说明MSC经体外诱导后已经初步具有血管内皮细胞的的某些分泌功能。

　　作为TEHV的支架,除需具备瓣膜的启闭机械功能外,还要易为种子细胞黏附、具有良好的相容性及有满意的生物力学特性。心脏瓣膜的结缔组织具有复杂的结构和分布形式，易于内皮细胞生长,足以耐受瓣叶启闭过程中不断变化的应力作用，在人工材料研究尚不完善的现阶段,猪去细胞支架是较理想的选择。既往研究表明，应用胰酶消化法可以制备满意的去细胞支架，加上猪主动脉瓣的形态学及空间结构与人体极为接近，且来源广泛，可以作为TEHV支架的较佳选择[67]。

　　TEHV的体外构建是种子细胞,支架及其相互作用下共同完成的,要求支架与细胞之间有良好的相容性，还要求细胞尽可能多地接种在支架上，并能牢固地黏附在支架上继续生长，因此支架表面理化性质的修饰及种子细胞的种植方法对TEHV的成功构建具有重要作用。大量研究表明细胞黏附和伸展与支架材料表面的Fn有关[89]，故本研究采用以Fn预处理去细胞支架，多次沉淀法种植细胞于支架上，以期达到促进细胞-支架间黏附，保证种子细胞在支架上有足够的细胞密度，达到体外构建TEHV的目的。结果表明，绵羊MSCECs在Fn预处理的猪去细胞支架上生长良好，可以在体外初步构建具有一定功能的TEHV。

　　笔者认为，MSCs获取简便，体外生长能力旺盛，在体外可以成功向血管内皮细胞诱导转化，可以作为TEHV的较为理想的种子细胞来源，在去细胞猪主动脉瓣支架上在体外构建TEHV是可行的。

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