凋亡蛋白因子cIAP2在新疆哈萨克族食管癌中的表达及临床意义

　　作者：陈艳， 王洪江2， 李卉3， 庞作良2， 李秀梅4, 姜孝芳3, 冉继华5, 谌宏鸣6, 李惠武 作者单位：(新疆医科大学1基础医学院生物化学与分子生物学教研室， 2附属肿瘤医院胸外科， 3基础医学院科研中心，4基础医学院形态中心;5 军区总医院检验科; 6新疆医科大学基础医学院组织胚胎学教研室, 新疆乌鲁木齐830011)

　　【摘要】 目的探讨新疆哈萨克族食管癌组织中凋亡蛋白因子cIAP2 mRNA的表达及其临床意义。方法采用RTPCR方法检测30例哈萨克族食管癌患者中cIAP2 mRNA的表达。结果30例哈萨克族食管癌患者癌组织与正常组织(手术切缘无癌组织)中cIAP2 mRNA表达阳性率分别为93.33%(28/30)与70.0%(21/30)。半定量光密度扫描后cIAP2 mRNA表达量在哈萨克族食管鳞癌患者癌组织及正常组织中差异有统计学意义(P<0.05)，但cIAP2的表达与分化程度、病理分期及有无淋巴结转移均无相关性。结论cIAP2 mRNA在哈萨克族食管癌患者癌组织中的表达高于正常组织，表明cIAP2通过抑制细胞凋亡，可能促进了哈萨克族食管癌的发生。

　　【关键词】 食管癌; 哈萨克族; cIAP2

　　The expression and significance of inhibitors of apoptosis protein cIAP2

　　in esophageal cancer in Xinjiang Hazak

　　CHEN Yan, WANG Hongjiang, LI Hui, et al

　　(Department of Biochemistry, Preclinical Medicine College, Xinjiang Medical University,

　　Urumqi 830011, China)

　　Abstract: ObjectiveTo study the expression and clinicl signficence of cIAP2 mRNA in esophageal cancer in Xinjiang Hazak. MethodsRTPCR was used to detect the mRNA of cIAP2 in 30 cases of the esophageal cancer. ResultsThe positive rate of cIAP2 mRNA expression in 30 cases of the esophageal cancer tissues, normal tissues were 93.33%(28/30) and 70.0%(21/30). The expression of cIAP2 was significantly increased in cancer tissues compared to the normal ones (P<0.05). While the expression level of cIAP2 mRNA was not significantly related to the degree of differentiation, depth of invasion and lymph node metastasis. ConclusioncIAP2 mRNA expression in esophageal cancer tissues higher than normal tissues, it provides valuable information for the prognosis of esophageal cancer.

　　Key words: esophageal cancer; Hazak; cIAP2

　　新疆北部以游牧为生的哈萨克族聚居区是我国食管癌的高发区之一，其死亡率高达155.9/10万，远高于全国平均水平(14.59/10万)[1]。该现象提示除环境致癌因素外，哈萨克族与汉族可能存在遗传易感性方面的差异。细胞凋亡受到各种因子的精细调控，细胞内固有的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)，在抑制细胞凋亡过程中起重要作用[2]。cIAP2是IAP家族中的主要成员，可抑制Caspase3 和Caspase7 以阻断细胞凋亡[3-4]。但是，cIAP2在哈萨克族食管癌组织中的表达情况以及在其发生、发展过程中的作用，目前尚不清楚。本研究通过RT PCR 的方法检测cIAP2 mRNA 在哈萨克族食管癌组织与正常(手术切缘无癌组织)组织中的表达，以探讨cIAP2在哈萨克族食管癌发病过程中的作用。

　　1材料与方法

　　1.1材料选用新疆医科大学附属肿瘤医院胸外科2007～2009年手术切除的食管癌标本30例，癌组织与正常组织各30例，全部为新疆哈萨克族患者。男性28例，女性2例，年龄37～75岁，平均年龄58岁。

　　1.2试剂和仪器Trizol(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒(美国Promega生物技术有限公司);2×即用PCR扩增试剂盒、DNA Marker、琼脂糖(上海生工生物技术服务有限公司);氯仿、异戊醇、无水乙醇、异丙醇(美国SigmaAldrich有限公司);引物由上海生工生物技术服务有限公司合成;iCyclerTM PCR扩增仪(美国BioRad公司)，Gel Doc XR凝胶成像分析仪(美国BioRad公司)。

　　1.3方法

　　1.3.1总RNA的提取总RNA提取按Trizol一步法进行。取2 μl RNA在紫外分光光度计下测定OD260，OD280并计算其比值，以确定所提取RNA的浓度和纯度(OD260/OD280=1.8～2.0)。同时取2 μl RNA在1%的琼脂糖凝胶电泳，观察所提取RNA的18 S、28 S条带，以确定提取的RNA的质量。

　　1.3.2cDNA合成及PCR反应将1 μg的总RNA以oligo(dT)为随机引物逆转录cDNA，再以合成的cDNA为模板，在PCR仪上扩增。cIAP2：5′ACAGGAAGCAAAGCACAGG3′(上游引物)，5′CTGTCCTAGACTTGTTCCGTTA3′(下游引物)，片段长度138 bp。GAPDH：5′CAAGGCCAACCGCGAGAAGATG3′(上游引物)，5′GTCCAGGGCGACGTAGCACAGC3′(下游引物)，片段长度300 bp。cIAP2扩增参数：95℃ 5 min, 95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环，最后72℃ 7 min。GAPDH扩增参数：95℃ 5 min, 95℃ 30 s，57℃ 30 s, 72℃ 30 s，35个循环，最后72℃ 7 min。

　　1.3.3产物鉴定取5 μl PCR反应产物加入1 μl上样缓冲液，经2%的琼脂糖凝胶电泳后，在Gel Doc XR凝胶成像分析仪下分析并保存结果。

　　1.3.4结果分析取得各样本的电泳图后，应用图像分析仪获得各样本cIAP2、GAPDH的PCR产物条带光密度值，并计算目的基因cIAP2与内参GAPDH光密度的相对比值，数据用于统计学分析。

　　1.3.5统计学处理采用SPSS16.0软件进行统计分析。cIAP2在哈萨克族食管鳞癌组织与正常(手术切缘无癌组织)组织中表达量的比较采用配对t检验分析;cIAP2与哈萨克族食管癌临床病理因素关系的比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1cIAP2 mRNA的表达在30例哈萨克族食管鳞癌患者癌组织与正常组织中cIAP2 mRNA表达阳性率分别为93.33%(28/30)和70.0%(21/30)。经光密度分析，cIAP2 mRNA在癌组织与相应的正常组织表达量有差异(P<0.05)，cIAP2 mRNA在癌组织中的表达较高，结果见图1、图2及表1。

　　图1cIAP2 2%琼脂糖凝胶电泳图M：Marker;1、3、5、7：癌组织;2、4、6、8：正常组织

　　图2GAPDH 2%琼脂糖凝胶电泳图M：Marker;1、3、5、7：癌组织;2、4、6、8：正常组织表1cIAP2 mRNA的表达(±s)分组nOD值t值P值正常组织300.50±0.542.6640.012癌组织300.74±0.51

　　2.2cIAP2 mRNA的表达与哈萨克族食管癌临床病理因素的关系cIAP2 mRNA的表达与分化程度、病理分期、淋巴结是否转移均无相关性(P>0.05)，见表2。

　　表2cIAP2 mRNA的表达与哈萨克族食管癌临床

　　病理因素的关系病理资料例数cIAP2 mRNA表达+-P分化程度低分化541>0.05高、中分化25241>0.05TNM分期Ⅰ、Ⅱ期550>0.05Ⅲ、Ⅳ期25232>0.05淋巴结转移无981>0.05有21201>0.05

　　3讨论IAPs 是近年来发现的新一类的细胞凋亡抑制基因。最初在杆状病毒中发现，将不表达P35 蛋白的杆状病毒株感染细胞，病毒仍能够产生一种蛋白以抑制宿主细胞凋亡，从而将其命名为凋亡抑制因子。所有IAP 成员都含有1～3 个BIR(baculovirus IAP repeat)结构[5]，BIR 结构域为IAPs 抑制细胞凋亡的功能区域，是发挥抗凋亡作用的关键部位[6-7]。cIAP2是IAP 家族的主要成员，定位于11q2223，含有3 个BIR 结构域和1个ring 结构域及1个card 结构。在正常组织中cIAP2 在肾、小肠、肝、肺中高表达，而在中枢神经系统中表达最低[8]。cIAP2可以直接抑制由caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程中的位于下游的caspase3、caspase7的活性，同时cIAP2 还可以抑制caspase9及caspase9前体的活性。因此cIAP2的表达增高后，必然会抑制caspase的活性，从而抑制细胞凋亡。Hofmann等[9]报道在肺腺癌中cIAP2mRNA高表达于早期(TNMⅠ)的肿瘤。有研究发现cIAP2在宫颈癌中表达也低于癌旁正常组织[10]。Kempkensteffen等[11]关于cIAP2的研究表明cIAP2在pT1期的肾细胞癌中表达高于pT2+3期，且高表达的肾细胞癌患者生存时间长。上述研究都说明了cIAP2在细胞凋亡以及肿瘤的发生、发展的过程中发挥着重要的作用。本研究应用半定量RTPCR方法检测了30例哈萨克族食管癌患者组织中cIAP2 mRNA的表达情况，结果显示cIAP2 mRNA在癌组织中的表达较相应正常组织高，并且表达量有差异，而cIAP2 mRNA的表达与分化程度、病理分期、淋巴结是否转移均无相关性，这表明在食管癌发生、发展的过程中cIAP2基因表达的改变，可能与其参与的凋亡调控机理有关。但cIAP2在肿瘤组织中高表达，抑制细胞凋亡的具体机理则有待于进一步研究。本研究对cIAP2在食管癌发病中的作用进行了初步的探索，这将为更进一步深入的研究奠定基础。

　　【参考文献】

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　　[10]Espinosa M, Cantú D,Herrera N, et al. Inhibitors of apoptosis proteins in human cervical cancer[J].BMC Cancer,2006, 6:45:110.

　　[11]Kempkensteffen C, Hinz S, Christoph F, et al. Expression parameters of the inhibitors of apoptosis cIAP1 and cIAP2 in renal cell carcinomas and their prognostic relevance[J]. Int J Cancer,2007,120(5):10811086.