肿瘤干细胞标志物ＣＤ１３３在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

　　作者：魏益平， 王梅， 华平， 吴澄， 曹永科， 杨艳旗， 陈炬， 张惠忠 作者单位：中山大学附属第二医院心胸外科，广东 广州 510120

　　【摘要】 【目的】 研究肿瘤干细胞标志物CD133在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中表达的临床意义。【方法】 用免疫组织化学方法检测77例手术切除的NSCLC组织中CD133的表达，分析CD133表达与患者吸烟指数、组织学类型、组织分化程度、淋巴结转移、肿瘤T分期、N分期和患者预后之间的关系。【结果】 77例NSCLC患者到随访结束时死亡率72.73%(56/77)，术后生存时间1～84(s=19)月、3年生存率为32.47%(25/77);无淋巴结结转移组NSCLC的中位生存时间和3年生存率高于有淋巴结转移组(P < 0.05)。CD133阳性表达率51.9%(40/77);CD133的表达与淋巴结转移呈正相关(r=0.246，P < 0.05)，与患者手术后生存期呈负相关(P < 0.05)。COX多因素分析仅癌肿病理类型和CD133蛋白表达为影响生存率的独立因素。 【结论】 NSCLC的淋巴结转移和病理类型与预后有密切关系;肿瘤干细胞标志物CD133蛋白的表达与NSCLC的淋巴结转移和预后密切相关。

　　【关键词】 非小细胞肺癌;肿瘤干细胞;CD133;淋巴转移; 预后

　　Expression of Tumor Stem Cell Marker CD133 in Non-small Cell Lung Carcinoma and Its Clinical Significance

　　WEI Yi-ping， WANG Mei， HUA Ping， WU Cheng， CAO Yong-ke，YANG Yan-qi， CHEN Ju， ZHANG Hui-zhong

　　(Department of Heart Surgery， The Second Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510120，China;2.Department of Surgery，The Second Affiliated Hospital，Nanchang University，Nanchang 330006，China)

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the expression of tumor stem cell marker CD133 in non-small cell lung carcinoma (NSCLC) and its relationship with NSCLC clinical significance. 【Methods】 Immunohistochemical staining was used to detect the expression of CD133 in 77 cases of patients with NSCLC. The relationship of the expression of CD133 with smoking index number， histological type， differentiation， lymphoid metastasis， T stage， N stage and survival time of the patients was analyzed. 【Results】 The death rate， live time (mid-live time)， and three years survival rate of NSCLC patients after operation were 72.73%(56/77)，1～84(s=19)month， 32.47% (25/77)， respectively. Both mid-live time and survival rate of three years after operation in NSCLC patients were longer in negative lymphonode metastasis group than the positive ones(P < 0.05). Out of 77 cases of NSCLC 40 cases (51.9%) showed positive expression of CD133. The expression of CD133 was associated positively with lymphoid metastasis (r=0.246， P < 0.05)， and inversely with survival time (P < 0.05). In a COX multivariate analysis， the survival of NSCLC was significantly influenced by the histological type and expression of CD133. 【Conclusion】 The prognosis of NSCLC were associated with lymphoid metastasis and histological type. The expression of tumor stem cell marker CD133 was associated with lymphoid metastasis and prognosis in NSCLC.

　　Key words： lung cancer; tumor stem cell; CD133; lymphatic metastasis; prognosis

　　肺癌细胞的侵袭转移是导致肺癌患者术后预后不良的主要因素。肿瘤干细胞(tumor stem cell， TSC)理论[1，2]认为TSC是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞特性的细胞群体，具有自我更新能力和多向分化潜能、是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断生长的根源。CD133是肿瘤干细胞的特征性表面标志物之一，人们已经发现恶性胶质瘤[3]、肝癌[4]和结肠癌[5]中CD133表达阳性细胞的成瘤性比阴性细胞强。本研究用免疫组织化学染色法检测77例肺癌组织中CD133的表达，并探讨肿瘤组织中CD133的表达与肿瘤大小、组织学类型、组织分化程度、淋巴结转移和患者术后生存期之间的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 试剂

　　CD133多克隆抗体(北京博奥森公司)，SABC试剂盒(武汉BOSTER公司)。

　　1.2 研究对像

　　所有患者知情同意;选取本院胸外科1996年 ～ 2001年手术切除并经病理证实，有术后随访资料的NSCLC患者77例。所有患者手术前均未进行放疗或化疗。根据影像学资料或手术记录确定肿瘤大小。查阅住院记录获得吸烟指数(吸烟指数=每天吸烟支数×吸烟年数)、组织学类型、组织分化程度和淋巴结转移情况。所有手术切除标本均用40 g/L的多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，厚4 μm。

　　1.3 免疫组化染色

　　石蜡包埋组织切片，脱蜡水化，蒸馏水漂洗5 min，在拘缘酸微缓冲液波炉抗原修复(95 ～ 98 ℃，维持20 min)。室温下冷却30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗5 min × 3次，体积分数为3% H2O2室温下孵育10 min，PBS漂洗5 min × 3次。一抗稀释度为(1∶200)，稀释剂为PBS，阳性对照为已知阳性的神经胶质瘤组织;以PBS代替一抗作阴性对照。4 ℃冰箱中过夜。第2天取出置室温1 h后，PBS漂洗5 min × 3次，滴加生化素标记的第二抗体，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗5 min × 3次。滴加链霉素化蛋白生物素复合物，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗5 min × 3次，二氨基联苯胺(DAB)显色3 ～ 10 min。蒸馏水漂洗，苏木精复染细胞核，中性树胶封片。

　　1.4 结果判断

　　DAB阳性染色为棕(黄)色。计数4个不同高倍视野下200个癌细胞，阳性细胞数 > 10%为阳性，≤10%为阴性。由3位病理科医生在不了解患者临床预后情况下独立进行观察判断，对独立判断不一致的病例再共同进行观察。

　　1.5 统计分析

　　数据用SPSS11.5计算，肿瘤大小的比较采用t检验，率的比较用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier曲线法和Log-Rank检验;Pearson法计算相关系数。用Cox多因素分析评价各因素对生存率的影响。α =0.05。

　　2 结果

　　2.1 NSCLC患者的术后生存情况

　　77例非小细胞肺癌(男57岁，女20岁);年龄29 ～ 79岁(中位年龄63岁)。术中发现淋巴结转移率50.7%(39/77)。本组病例到随访结束时(2004年12月)病死率72.73%(56/77)。术后生存时间1 ～ 84(s=19)月，3年生存率为32.47%(25/77)。

　　2.2 NSCLC组织中CD133的表达情况与临床特征的关系

　　NSCLC组织中CD133蛋白阳性染色为棕/黄色(图1)，与CD133表达阴性的支气管上皮和肺泡组织(图2)比较差异明显。CD133阳性表达率51.9%(40/77);CD133阳性表达组术后生存期的中位生存时间(10个月)明显短于阴性表达组(37个月)，3年生存率分别为15.0% (6/40)和51.4% (19/37)，有统计学差异(P=0.001，表1，图3)。CD133阳性组淋巴结转移率为64.1%(25/39)较阴性组39.8%(15/38)高，两组比较有统计学差异(r=0.246，P < 0.05);CD133的阳性表达与肿瘤大小、组织学类型、组织分化程度均无相关性(P >0.05，表2)。

　　2.3 NSCLC患者的临床特点与预后的关系

　　CD133阳性表达、术中有无胸腔积液、T分期、N分期和肿瘤病理类型与患者术后生存率有相关性(P < 0.05，表1)。无淋巴细结转移和有淋巴结转移组的中位生存期分别为30月和11月，3年生存率分别为50.0%(18/36)和17.1%(7/41)，差别有统计学意义 (P < 0.05， 图4)。患者吸烟指数、性别、年龄、肿瘤细胞分化程度等临床特点均未见与长期生存率无关。

　　2.4 影响预后的多因素分析

　　经COX多因素生存率分析，肿瘤病理类型和CD133阳性表达是影响NSCLC患者预后的独立因素(P < 0.05，表3)。

　　3 讨论

　　肺癌细胞的侵袭转移是导致肺癌患者术后预后的不良的主要因素[6]。人们对肺癌发生及发展机制已探索多年，但由于肿瘤病因复杂、具体发病机制不明，缺乏有针对性的治疗手段，患者的长期生存率无明显改善。传统理论认为肿瘤生长是所有肿瘤细胞一起增殖的结果，因而治疗方法主要是针对肿瘤组织内的大多数细胞，结果常因肿瘤转移和复发使治疗失败。TSC又称为癌干细胞(cancer stem cell，CSC)，包括干细胞样细胞(stem/ike cells)、癌起始细胞(cancer initiating cell，CIC)[1]和肿瘤起始细胞(tumor initiating cells， TIC)等[7]。近年来TSC的发现、确认和特性的研究为揭示肿瘤发病机制，乃至肿瘤靶向治疗提供了新线索。癌干细胞因具有自我更新和潜在的强增殖能力，在肿瘤发生发展、复发转移中均发挥着很重要的作用;肿瘤干细胞理论的提出对传统的肿瘤治疗方式提出了巨大挑战，提示肿瘤治疗可靶向性杀死肿瘤干细胞，使根治肿瘤和防止肿瘤复发和转移成为可能。

　　CD133是传统的造血干细胞、血液肿瘤和内皮祖细胞的标志物[8]。Sussman等[9]发现CD133表达阳性细胞与实体瘤的发生、发展有关。Atsushi Suetsugu等[4]从肝癌细胞株Huh-7中CD133阳性的细胞增殖能力比CD133阴性细胞强。临床研究工作中迄今报道的成瘤性最强的是脑瘤干细胞[10]，每只NOD/SCID小鼠接种100个CD133阳性肿瘤干细胞，结果在接种后6个月内形成肿瘤;而每只接种1×105个CD133阴性非肿瘤干细胞的小鼠在相同时间内未形成肿瘤。Catherine等[5]将结肠癌组织中的CD133阳性细胞移植到NOD/SCID小鼠肾被膜下，发现所有结肠癌CIC都是CD133阳性细胞而哪些CD133阴性细胞没有致瘤性。

　　2005年Kim等[11]成功在分离了支气管肺泡干细胞(bronchioalveolar stem cells，BASCs)，BASCs具有多向分化和自我更新能力，在培养过程K-ras基因可刺激BASCs扩增并产生肺腺癌细胞。这为肺癌肿瘤干细胞的存在提供了一定的证据;但该研究只说明来源于支气管的上皮干细胞可被诱导分化成恶性肿瘤细胞，并未直接从肺癌组织中分离出肺癌干细胞。且到目前为止国内外文献未见从人类肺癌组织中分离出肺癌干细胞的报到。Hilbe等[12]研究发现在66例NSCLC患者肿瘤组织中43例CD133阳性细胞增多，其中部分CD133阳性细胞呈管状排列，并得出NSCLC组织中的CD133阳性内皮祖细胞增多是促使肿瘤血管生成和肿瘤生长的原因之一的结论。

　　本研究发现肺癌标本中的CD133阳性表达与患者的淋巴转移和预后相关，即患者肺癌组织中的CD133表达阳性细胞越多，其肿瘤发生淋巴转移的可能性就越大，术后生存时间也就越短。提示肿瘤组织中CD133阳性细胞越多，肿瘤组织中含有的TSC就越多，手术后残留在患者体内的TSC也就较多;这些残留的TSC通过自我更新和多向分化，而发生肿瘤复发和转移。上述结果提示CD133可能就是肺癌干细胞的特导性表面标志物，且Hilbe等[12]发现的NSCLC组织中的CD133阳性内皮祖细胞可能就是肺癌干细胞。

　　肿瘤干细胞标志物CD133表达与NSCLC的临床特征和预后的关系的发现为今后肺癌TSC特异性标志物的确定和肺癌TSC的分选提供了重要线索。我们拟从肺癌组织中分离出CD133阳性细胞群进行体外培养、成瘤试验和药敏试验，以确定CD133是否为肺TSC的特征性标志物并分离出肺癌TSC。为肺癌的发生、发病机制研究奠定基础，为今后NSCLC的治疗指明方向。

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