胸腔积液的病理诊断研究
发表时间：2010-07-13 浏览次数：542次
作者：张文霞 刘典晓 董圣军 作者单位：1 滨州职业学院医学系 滨州市 256600;2 滨州医学院附属医院胸心外科
【关键词】 胸腔积液;冰冻切片;免疫组化
胸腔积液是多种胸部疾病，特别是肿瘤性疾病的常见伴发体征，甚至为患者首发表现，明确胸腔积液的性质对于疾病的诊断、治疗有重要意义。一般病理检查通常离心、涂片、HE染色，但由于细胞分散、染色效果不好、重复性差等原因，诊断的阳性率低，易漏诊。尤其是增生的间皮细胞和转移性腺癌;未分化癌与小细胞癌和淋巴瘤之间不易区别，疑诊病例较多，对临床帮助不大。我们将胸腔积液离心后进行冰冻切片常规HE染色，同时进行相应的免疫组化标记，明显提高了胸水细胞诊断的阳性率及准确性。该方法可重复性高，细胞清晰，能明确诊断，部分病例能明确肿瘤的类别和来源，有重要的临床应用价值。
1 资料与方法
1.1 临床资料 2006年5月—2008年12月我们共收集胸水标本64例，其中男性28例、女性36例，年龄32～82岁，平均年龄51.6岁。经组织学或结合临床资料证实腺癌12例，鳞癌8例，恶性上皮型间皮瘤4例，间皮增生40例。
1.2 方法 ①将送检的胸水直接用一次性吸管吸取下面沉淀的部分30 ml于试管内，2 500 r/min，离心10 min。将上清液去掉，离心沉淀物涂片1张、HE染色。沉淀的部分放在冰冻切片机上冷冻头上，然后加入OCT包埋剂进行切片。②胸水离心沉淀物少就直接倒去上清液，先在冰冻切片机的冷冻头上加入OCT包埋剂，然后将胸水离心沉淀物放在上面进行切片。③胸水离心沉淀物常规切片6张：1张HE染色，5张免疫组化染色。④制作免疫组化染色的冷冻切片必须冷藏保存，然后根据需要进行免疫组化染色。⑤免疫组化染色标记细胞角蛋白(cytokeratin，CK)、上皮膜抗原(EMA)、肺癌相关抗原(LCA)、间皮细胞、波形蛋白(vimentin)。免疫组化染色方法：采用即用型快捷免疫组化MaxvislonTM试剂盒，试剂及抗体和免疫组化阳性片均由福建迈新生物技术公司提供，阴性对照采用PBS作为一抗。
染色步骤：①切片室温干燥后，入4℃丙酮固定10 min，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3 min。②根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复，除细胞角蛋白用胰酶消化外，间皮细胞、vimentin、LCA、EMA都要柠檬酸高温修复(按说明操作)。 ③每张切片加1滴3%过氧化氢，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min。 ④每张切片加1滴自选1抗体，室温下孵育60 min。⑤PBS冲洗3次，每次3 min。⑥除去PBS液，每张切片加2滴新配制的DAB溶液10 min。⑦自来水洗，苏木素复染直至中性树胶封固。
1.3 统计学处理 采用χ2检验，检验水准α=0.01，P<0.01认为差异有统计学意义。所有统计均由SPSS 10.0软件完成。
2 结果
送检的64例胸水直接离心涂片HE染色诊断阳性细胞7例，阴性39例，可疑18例。应用冰冻切片技术联合免疫组化检查结果阳性细胞24例，阴性38例，可疑阳性仅2例;χ2=22.13，P<0.01，见表1。冰冻切片免疫组化标记结果见表2。表1 64例胸水单纯涂片与冰冻切片诊断结果表2 冰冻切片免疫组化标记结果
3 讨论
胸腔积液是多种胸部疾病特别是恶性肿瘤的常见伴发体征，甚至为患者首发症状。通过胸腔积液对明确病变性质及类型有重要意义，对疾病的治疗也有重要指导意义。一般的胸水病理检查仅仅行单纯离心、涂片、HE染色，光镜下观察，但由于细胞分散、染色效果不理想，又因细胞容易堆积成团，其诊断的阳性率较低，特别是小细胞肿瘤难以和间皮瘤、淋巴瘤、未分化肿瘤细胞区别。
冰冻切片技术是一种成熟的病理制片技术，已广泛用于病理诊断。其与直接涂片法比较，可全面、简单、快捷的收集积液内的肿瘤细胞;切片质量高，视野清晰，细胞分布均匀，可明显提高肿瘤细胞的阳性检出率和诊断准确性;而且细胞相对较集中，可明显节约诊断时间，提高工作效率;特别对于有较大组织块残存的样本，可重复性切片。我们在胸水细胞病理诊断中采用冰冻切片技术联合免疫组化，大大提高了胸水细胞诊断的准确性，免疫组化又能准确的定位肿瘤细胞的表达抗原，确定肿瘤细胞的属性及来源，明显提高了阳性细胞的检出率。不仅有助于良、恶性的判断，而且对常规涂片中难以鉴别的间皮细胞瘤和转移性腺癌的识别以及对分化差的肿瘤的病理诊断或肿瘤类型的确定有重要作用。
细胞角蛋白(CK)广泛存在于各种上皮细胞及上皮源性肿瘤细胞中，故某些低分化腺癌可呈强阳性表达，而间皮细胞则为弱阳性，在间皮瘤中也可为强阳性，所以CK可作为上皮源性肿瘤的重要标记物，但不能完全区分腺癌与间皮瘤。EMA是一种高分子质量跨膜糖蛋白，在正常腺细胞中表达率很低;但在癌组织由于存在畸形糖基化和糖基化不完全，使其核心蛋白暴露出新的蛋白表位或新的糖抗原，从而成为上皮组织来源肿瘤特异的抗原之一。LCA对肺癌诊断较高的敏感性、特异性，可用于肺癌的辅助诊断。波形蛋白(vimentin)是间叶源性肿瘤细胞的标记物，绝大多数癌为阴性表达，而间皮瘤呈阳性表达，因此可用于区分腺癌与间皮瘤。我们应用一组抗体进行检测比较，不仅提高了诊断的阳性率，而且对腺癌和恶性间皮瘤起到鉴别诊断作用。
在操作中应注意几个问题：①冰冻切片不能太厚，一般4 μm连续切片，同时应使用粘胶片，切片后如果不染色，必须吹干，冷藏保存。②在胸水细胞离心沉淀较少的情况下，倒去上清液，先在冰冻切片机的冷冻头上加入OCT包埋剂，然后将胸水离心沉淀物放在上面进行切片。 ③如果血性胸水，可加入0.5%氯化铵溶液离心去除红细胞效果较好。 ④在采集胸水时最好使用一次性吸管吸取下面沉淀部分，胸水应新鲜。⑤免疫组化观察时应注意，胞浆和细胞核阳性色差异，特别是恶性间皮瘤阳性部位在胞膜部分，免疫组化还可以根据病例不同选择不同的抗体。
综上所述，冰冻切片联合免疫组化检测可明显提高胸积液细胞诊断的阳性率及准确性，且操作简单、方便快捷，对肿瘤细胞的诊断和鉴别诊断具有重要意义，可为临床正确选择治疗方案提供较为可靠的依据。
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