脂质体介导的VEGFC反义寡核苷酸对肺癌微淋巴管生成的影响

　　作者：丁成智 钱永跃 郭旭峰 徐中华 徐忠恒 作者单位：苏州大学附属第二医院胸心外科，江苏 苏州 215004

　　【摘要】目的 观察脂质体介导的血管内皮生长因子C (VEGFC) 反义寡核苷酸对肺癌裸鼠皮下种植瘤模型微淋巴管生成的影响。方法 建立BALB/C小鼠皮下肺癌模型30只，随机分为磷酸盐缓冲液对照组 (PBS组)、正义寡核苷酸对照组 (SODN组) 和反义寡核苷酸干预组 (AODN组)。接种人肺腺癌细胞株A549后24 h内，分别用PBS、SODN及AODN皮下注射进行治疗，观察小鼠肿瘤的生长情况。4 w后，处死动物，留取瘤体标本，采用RTPCR、Western印迹和免疫组织化学方法检测VEGFC反义寡核苷酸对种植瘤中VEGFC表达水平和微淋巴管生成的影响。结果 AODN组VEGFC mRNA和蛋白表达量降低 (4.61±1.57),与对照组比较差异显著(P<0.05);种植瘤内微淋巴管密度为 (3.2±1.7)，明显低于对照组(P<0.01)。结论 脂质体介导的VEGFC反义寡核苷酸可以显著降低肺癌裸鼠皮下种植瘤模型VEGFC的表达水平，并对其微淋巴管生成具有较强抑制作用。

　　【关键词】 肺癌;血管内皮生长因子C;基因治疗

　　非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌80%，随着对综合治疗和个体化治疗的认识不断加深和推广，NSCLC的治疗已经有了很大提高，但目前5年生存率仍低于15%〔1〕。一般认为，肿瘤细胞的侵袭性和转移性是决定肿瘤类型和患者死亡的主要原因，因此明确肿瘤细胞转移和肿瘤细胞之间相互作用的分子机制对肿瘤的治疗有重要意义。目前认为，抗肿瘤的血管生成和淋巴管生成是有效治疗肿瘤的主要途径之一〔2〕。我们前期研究结果已经证实，肺癌细胞通过高表达血管内皮生长因子C(VEGFC) 与淋巴管内皮细胞VEGFR3特异性结合刺激肺癌新生淋巴管生成〔3〕。本研究通过建立肺癌裸鼠皮下种植瘤模型，研究脂质体介导的VEGFC反义寡核苷酸对肺癌细胞VEGFC表达水平和种植瘤内微淋巴管生成的影响，来寻找肺癌基因治疗新方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞及动物

　　肺癌A549细胞株由山东大学齐鲁医院胸外科胡国强教授惠赠，生长特性为贴壁生长，传代培养。4～6周龄雌性BALB/C系裸鼠30只，购自上海斯莱克实验动物有限公司。

　　1.1.2 主要试剂

　　RPMI1640培养基购自GIBCO公司,胎牛血清系杭州四季青产品。全硫代磷酸化修饰的寡核苷酸均由上海生工公司合成，VEGFC反义寡核苷酸序列为5′CCCACATCTGTAGAGGGAGGACTC3′，正义寡核苷酸序列为5′TACGTAGTATGGTGTACGATC3′;RTPCR试剂购自Promega公司。VEGFC上游引物序列为5′CATGTACGAACCGCCAG3′,下游引物序列为5′TTGGCTGTTTGGTCATTGGC3′，扩增产物320 bp，βactin上游引物序列为5′ACGTCTGCTGGAAGGTGGAC3′，下游引物序列为5′GGTACCACCATGTACCCAGG3′，扩增产物163 bp，由上海生工公司合成。兔抗人多克隆抗体VEGFC、VEGFR3及免疫组织化学试剂盒PV9000均购自北京中山生物技术公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 人肺腺癌细胞株A549裸鼠皮下种植瘤模型建立和分组

　　取对数生长期A549细胞，经2.5 g/L胰酶+0.2 g/L EDTA消化液消化后，PBS洗涤2次，离心5 min(1 500 r/min)，弃上清，加生理盐水制成单细胞悬液，细胞密度为1×106个/ml，以0.2 ml/只接种于BALB/C小鼠右腋皮下。建模1 w后，随机分为磷酸盐缓冲液对照组(PBS组)、正义和反义寡核苷酸对照组 (SODN组和AODN组)，每组各10只。

　　1.2.2 脂质体(Lip)+ODN复合物的制备和作用

　　FuGENE6 Lip由阳离子脂质DOTMA和中性磷脂DOPE按1∶1(W/W)比例在膜过滤生理盐水中合成，每毫升含1 mg。按1 μg∶2 μl的比例将AODN和SODN及脂质体轻柔混匀，室温下静置30 min，制成Lip+ODN复合物。

　　1.2.3 干预方法和动物取材

　　寡核苷酸用量为每次10 mg/kg体重，隔日1次，每周3次，共3 w，分别抽取0.2 ml浓度为8 mg/μl的正义和反义VEGFC寡核苷酸PBS溶液给SODN和AODN组小鼠注射，PBS组仅注射0.2 ml PBS。第4周末时所有动物模型均存活，颈椎脱臼法处死裸鼠，立即剖出肿瘤，置入10%中性甲醛常规固定标本石蜡包埋，行HE染色。

　　1.2.4 种植瘤内VEGFC mRNA和蛋白表达量检测

　　按照Trizol试剂盒说明提取种植瘤中总RNA，用引物Oligo dT反转录 (RT) 合成cDNA链，RT反应产物用作PCR的模板DNA，使用特异性引物进行PCR，βactin作为内参照。取10 μl PCR 产物在2%琼脂凝胶电泳，紫外灯下观察电泳带，应用Smart View凝胶成像分析系统及其分析软件，以VEGFC带峰面积与内参照βactin带峰面积的比值表示VEGFC mRNA水平。Western印迹检测VEGFC蛋白的表达。主要步骤包括：细胞总蛋白的提取，SDSPAGE电泳，蛋白质转印及抗体染色，Ecl试剂检测、X光电曝光及显影。

　　1.2.5 免疫组织化学染色计数微淋巴管密度

　　采用免疫组化Wax Envision多聚复合物酶标法，具体步骤按照试剂盒说明书进行。阴性对照采用0.01 mol/L PBS代替一抗。VEGFR3蛋白阳性表达产物定位于微淋巴管内皮细胞，呈棕红色颗粒。肿瘤微脉管计数方法：判定标准为由内皮细胞形成条状、隙状等孤立或簇状结构棕红染色及有管腔者，先在低倍光镜(×40)视野下寻找癌周组织微脉管最密集区即“热点”(hot spot)，然后在高倍镜(×200)下观察，以4个高倍镜视野脉管的平均数表示脉管数。

　　1.3 统计学方法

　　数据以x±s表示，应用 SPSS l3.0软件包单因素方差分析和q检验。

　　2 结 果

　　2.1 VEGFC反义寡核苷酸对种植瘤内VEGFC mRNA和蛋白表达的影响

　　PBS组、SODN组和AODN组种植瘤VEGFC mRNA表达量分别为24.13±3.34、20.74±3.59和4.61±1.57。AODN组种植瘤VEGFC mRNA表达显著减少，与对照组比较差异显著(P<0.05)，见图1。Western印迹检测结果显示AODN组种植瘤VEGFC 蛋白表达量亦明显减少，见图2。

　　2.2 VEGFC反义寡核苷酸对种植瘤微淋巴管生成的影响

　　PBS组、SODN组和AODN组种植瘤内微淋巴管密度分别为43.4±2.3、32.4±2.1和3.2±1.7，AODN组种植瘤内微淋巴管密度显著减少，与对照组比较差异显著(P<0.01)，见图3。

　　3 讨 论

　　肿瘤细胞的血性和淋巴转移是影响患者生存的重要因素。而肺癌患者早期即可发生淋巴转移，这是长时间困扰临床医生的一个难题。有研究报道，肺癌前哨淋巴结转移往往预示着临床结果的高危性〔3〕。因此，研究清除淋巴转移的分子机制及有效抑制肿瘤细胞的淋巴转移显得十分必要。

　　肿瘤的淋巴管生成是指在肿瘤原位形成新的毛细淋巴管，它仅由单层淋巴内皮细胞组成、基底膜不完整、管壁薄、流速缓慢、剪切力低且淋巴与组织间液的组成基本相同，因而有利于肿瘤细胞进入淋巴管道，进而形成淋巴转移和远处转移〔4～7〕。研究发现VEGF在肿瘤的生长和血管和淋巴管转移中发挥重要的作用，特别是VEGFC是作为特异性淋巴管内皮细胞刺激因子，可通过诱导微淋巴管的生成使得肿瘤“淋巴管生成”失调控，并影响淋巴管内皮的通透性,从而促进肿瘤转移〔5～7〕。Zip等〔8〕通过建立动物肿瘤转移模型，研究VEGFC的促淋巴管生成机制，结果提示抑制VEGF和VEGFR的表达能显著增加肿瘤对治疗的敏感性。Miyata等〔9〕研究发现VEGFC在肿瘤淋巴管生成中起决定作用。Maekawa等〔10〕研究发现在T1肺腺癌中VEGFC mRNA和蛋白质水平在T1期肺腺癌中有淋巴结转移和无转移淋巴结之间无明显差异，但5年生存率优于转移淋巴结的T1期肺腺癌。因此，进一步探讨肺癌中VEGFC 介导的淋巴管生成机制及其干预措施对于寻找有效的肺癌抗淋巴管生成治疗方法具有重要的实验和临床意义。

　　本研究通过建立肺癌裸鼠皮下种植瘤模型，应用反义核酸技术，根据核酸碱基互补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结合的干扰DNA，从而影响靶基因的表达。寡核苷酸干预后，RTPCR和Western印迹检测结果显示AODN组种植瘤VEGFC mRNA和蛋白表达量明显为低，与PBS和SODN组比较差异显著。分别从基因和蛋白质水平上证实了VEGFC反义寡核苷酸可明显抑制肺癌细胞VEGFC基因的表达，表明VEGFC可能在促进肺癌淋巴管生成方面扮演着重要角色，同时也表明，VEGFC反义寡核苷酸在抑制肺癌淋巴管生成中发挥了重要作用。

　　淋巴管密度是评价肿瘤淋巴管生成的重要指标。本研究中，AODN组种植瘤内微淋巴管密度显著低于两对照组，提示VEGFC反义寡核苷酸靶向抑制肺癌A549细胞VEGFC蛋白的表达，从而减少了VEGFC与肿瘤淋巴管内皮细胞上特异性受体VEGFR3的结合，进而降低肺癌淋巴管内皮细胞有丝分裂和迁移游走的能力，抑制肺癌微淋巴管的生成。如此，将可能阻断肺癌细胞通过新生淋巴管转移至远处淋巴结的通道，有效防止淋巴结远处转移。

　　综上所述，我们认为VEGFC反义寡核苷酸能有效抑制肺癌细胞VEGFC的微淋巴管基因表达，进而抑制肺癌细胞的增殖和淋巴转移，可作为一种抗肺癌淋巴管生成治疗方法。

　　【参考文献】

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　　3 郭旭峰，胡国强，尹秋伟，等.PTTG、VEGFC 基因过表达与非小细胞肺癌发生、发展的关系及其临床意义〔J〕.山东大学学报(医学版)，2006;4(11)：11759.

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　　10 Maekawa S，Iwasaki A，Shirakusa T,et al.Correlation between lymph node metastasis and the expression of VEGFC，VEGFD and VEGFR3 in T1 lung adenocarcinoma〔J〕.Anticancer Res，2007;27(6A)：373541.