乙酰肝素酶反义寡核苷酸对肺癌A549细胞侵袭力的抑制作用

　　作者：陈志涛 田 辉1 岳韦名1 李 林1 亓 磊1 朱应超1 作者单位：(山东大学附属济南市中心医院胸外科，山东 济南 250013)

　　【摘要】 目的 探讨乙酰肝素酶(heparanase，HPSE )反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)对人肺癌A549细胞侵袭力的抑制作用。方法 设计合成互补于HPSE mRNA起始密码区的HPSE ASODN，以阳离子脂质体Lipofectin包埋后转染人肺癌A549细胞进行培养，采用流式细胞分析技术和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测肺癌A549细胞HPSE蛋白及其mRNA表达的变化;以Matrigel细胞侵袭试验对HPSE ASODN对肺癌A549细胞侵袭的抑制进行检测。结果 ASODN各组与正常对照组和脂质体组比较及ASODN各组间比较HPSE mRNA和蛋白的表达及细胞侵袭力均受到明显抑制 (P<0.01);ASODN在终浓度为100、200、400 nmol/L时对肺癌A549细胞侵袭力的抑制率分别为55.6%、82.3%和91.2%。结论 HPSE ASODN通过下调HPSE mRNA和蛋白的表达可显著抑制肺癌A549细胞的侵袭力，并呈剂量依赖性。

　　【关键词】 肺肿瘤;乙酰肝素酶; 反义寡核苷酸

　　Inhibition of invasiveness of human lung cancer cell lines by heparanase antisense oligodeoxynucleotide

　　CHEN ZhiTao，TIAN Hui，YUE WeiMing，et al.

　　Department of Thoracic Surgery，Ji′nan Central Hospital Affiliated to Shandong University，Ji′nan 250013，Shandong，China

　　【Abstract】 Objective To evaluate the inhibitory effect of HPSE antisense oligodeoxynucleotide (ASODN) on the invasiveness of human lung cancer A549 cell lines.Methods HPSE ASODN which was complementary with initiation codon region of HPSE mRNA was designed and synthesized.After embedded by cation lipofectin，it was transfected into A549 cells of human lung cancer.The expression of HPSE protein and HPSE mRNA in A549 cell lines were detected by flow cytometry and RT PCR.Meanwhile Matrigel invasive assay was used to measure the inhibitory effect of HPSE ASODN on the invasiveness of human A549 cell lines.Results The HPSE protein and HPSE mRNA expression and invasiveness of human A549 cells treated with ASODN of different concentrations were significantly decreased as the ASODN concentration increasing.There was a significant difference between control group and each group of ASODN respectively(P<0.01)，between lipofectin group and each group of ASODN respectively(P<0.01)，and among the groups of ASODN (P<0.01).Besides，the difference of inhibitory effect was significant among the cells treated with different ASODN concentrations (P<0.01).The inhibition rates of A549 cell invasiveness were 55.6%，82.3 % and 91.2% treated by ASODN at final concentration of 100，200 and 400 nmol/L respectively.Conclusions By downregulating the expression of HPSE mRNA and HPSE protein，HPSE ASODN has significant inhibitory effect on the invasiveness of human A549 cell line in a dosedependent manner.

　　【Key words】 Lung neoplasm;Heparanase;Antisense oligodeoxynucleotide

　　侵袭和转移是肺癌的重要特征，是导致肺癌病人死亡的主要因素。乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)是迄今为止发现的唯一能够降解细胞外基质和基底膜中的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)的酶，对于肿瘤细胞的侵袭和转移具有重要作用〔1〕。本研究采用反义寡核苷酸(ASODN)技术转染人肺癌A549细胞，用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和流式细胞学方法检测A549细胞HPSE mRNA和蛋白表达，同时采用基质凝胶侵袭实验对转染细胞的侵袭力进行检测，以初步探讨HPSE ASODN对A549细胞的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养 人肺癌细胞株A549购自中科院上海细胞所，所有培养工作均在无菌环境下进行，培养于含有10%小牛血清的RPMI1640中，实验所用细胞均处于对数增长期。

　　1.2 反义寡脱氧核苷酸的设计、合成 根据HPSE基因序列(GenBank accession number：AF155510)。设计互补于HPSE mRNA起始密码区(AUG及其下游17个核苷酸序列)ASODN序列：ASODN 5′GGCTTCGAGCGCAGCAGCA13′，在GenBank中行Blastn证实ASODN仅与HPSE基因相应位点匹配。以上寡核苷酸序列由上海生工生物工程公司合成、纯化，并行硫代磷酸化修饰，同时以荧光素FITC标记末端碱基。

　　1.3 实验分组 实验设正常对照组(转染时不加脂质体，不加寡核苷酸)、脂质体对照组(转染时仅加脂质体，不加核苷酸)、ASODN组(转染时加脂质体和100、200、400 nmol/L ASODN)。根据预试验结果，各实验组在以上3种终浓度时转染率较高且不同浓度间无显著差别，故选择此浓度梯度进行实验。

　　1.4 寡核苷酸的转染 采用阳离子脂质体Lipofectin(Invitrogen公司)转染。将细胞接种于6孔板，置于37℃、5% CO2孵育箱培养至约70%覆盖率。去除培养基，以温热无血清RPMI1640漂洗细胞2次。将寡核苷酸分别溶于100 μl无血清RPMI1640，另取10 μl Lipofectin溶于90 μl预暖的无血清RPMI1640，分置室温30 min后将两者轻柔混合，室温孵育15 min，以800 μl无血清RPMI1640稀释LipofectinODN复合体后轻铺于细胞上，不加抗生素，37℃、5%CO2孵箱孵育6 h。培养过程中设复孔常规以台盼蓝染色法检测细胞死亡率，各组细胞死亡率均≤5%。

　　1.5 RTPCR测定HPSE mRNA的表达 取转染后继续培养48 h的肺癌A549细胞，以TRIzol试剂(Gibco公司)提取总RNA，以紫外分光光度计测定RNA纯度并定量，在1%甲醛变性凝胶上电泳验证RNA完整性。RTPCR采用一步法试剂盒(KaTaRa公司)按厂家推荐步骤进行，扩增体系为50 μl。本实验以 βactin作为对照，对模板用量标准化。HPSE和βactin分两管进行扩增。引物序列参照文献〔1〕设计，由上海生工生物工程公司合成。HPSE(585 bp)上游5′TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC3′;下游5′GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC3′;βactin(250 bp)上游5′CAGAGCAAGAGAGGCATCC13′，下游5′GGATAGCACAGCCTGGATAG3′，RTPCR条件：50℃逆转录30 min，95℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环后，72℃充分延伸10 min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，PCR产物电泳结束后，紫外灯下观察照相并用Gel 1D凝胶图像分析系统分析测定其光密度，各电泳条带净密度值按下列公式计算：净密度值=条带平均密度×面积(Pix),以HPSE条带净密度与βactin条带净密度的比值表示HPSE mRNA相对表达量进行半定量比较。

　　1.6 HPSE的流式细胞学检查 取单细胞悬液1×106/ml，加入兔抗人HPSE单克隆抗体工作液100 μl(购自武汉博士德公司)，室温孵育30 min，加入PBS10 ml洗涤1次，弃上清，加入羊抗兔FITC IgG二抗工作液100 μl，避光室温孵育30 min，加入PBS 10 ml离心同上，弃上清以除去未结合的荧光二抗，上机检测前加入PBS 0.1 ml经500目铜网过滤后上机检测。设HPSE一抗的本底对照和阴性对照。采用美国Beckman Coulter公司生产的EpicsXLII型流式细胞仪，激发光源为15 mW氩离子激光器，激发波长为488 nm，应用Expo32ADC进行免疫荧光数据分析，用多循环AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析。检测前以flowcheckTMFluorpheres(10 μm)荧光微球(REF 6605359.Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA 92835)作为标准样品调整仪器CV值在2%以内。以荧光指数表示HPSE蛋白的相对含量。

　　1.7 基质凝胶侵袭实验检测细胞侵袭力 采用BD公司24孔基质凝胶侵袭小室，上下室间滤膜孔径为8 μm，滤膜的上室面覆有细胞外基质凝胶，可模拟体内的细胞外基质和基底膜环境。取转染后继续培养24 h的A549细胞，以无血清RPMI1640制成2×105个/ml单细胞悬液，取200 μl移入上室内，下室内加入500 μl含有10%小牛血清的RPMI1640，置于37℃、5% CO2孵箱内孵育48 h后取出，以棉签小心刮除滤膜上室面的细胞，侵袭到下室面的细胞以甲醛固定(HE染色)，在×400光镜下随机取6个视野计数细胞数，以其均值表示侵袭细胞数。细胞侵袭力抑制率=(脂质体对照组每视野侵袭细胞数不同浓度ASODN组每视野侵袭细胞数)/脂质体对照组每视野侵袭细胞数×100%。

　　1.8 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS13.0软件包进行两样本间均数间独立样本的t检验及多个样本间的单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 HPSE ASODN 转染A549细胞情况 HPSE ASODN 在终浓度为100、200、400 nmol/L时平均转染效率分别为97%、98%、95%，三种终浓度的转染率比较无显著差别(P>0.05)。

　　2.2 RTPCR检测ASODN对HPSE mRNA表达抑制作用 半定量RTPCR扩增产物电泳结果(图1，表1)显示：正常对照组和脂质体对照组之间比较，HPSE mRNA表达量差异不显著(P>0.05);随着ASODN浓度的增加，HPSE mRNA表达依次下降，ASODN的抑制作用具有明显的剂量依赖性。ASODN各组分别与正常对照组和脂质体对照组比较及ASODN各组间HPSE mRNA 表达比较差异显著(P<0.01)。

　　1：正常对照组;2：脂质体对照组;3：ASODN组(100 nmol/L);4：ASODN组(400 nmol/L)

　　图1 RTPCR检测HPSE mRNA的表达

　　2.3 流式细胞学检测ASODN 对HPSE蛋白表达的抑制作用 流式细胞学检测结果(表1)显示：正常对照组和脂质体对照组之间比较， HPSE 蛋白表达的荧光指数(FI)差异不显著(P>0.05);随着ASODN浓度的增加，HPSE蛋白表达的FI依次减小且呈明显剂量依赖性;ASODN各组分别与正常对照组和脂质体对照组比较及ASODN各组间比较差异显著(P<0.01)。表1 HPSE ASODN对A549细胞HPSE蛋白及其侵袭力的影响与正常对照组和脂质体组比较：1)P<0.01;与ASODN 100 nmol/L 组比较：2)P<0.01;与ASODN 100、200 nmol/L组比较：3)P<0.01

　　2.4 ASODN对A549细胞侵袭力的抑制作用 正常对照组和脂质体对照组之间比较，侵袭细胞数无明显变化(P>0.05);随着ASODN浓度的增加，侵袭细胞数依次减少，ASODN 各组分别与正常对照组和脂质体对照组比较及ASODN 各组间侵袭细胞数比较差异显著(P<0.01);ASODN对细胞侵袭力的抑制作用呈明显剂量依赖性(表1)。即ASODN在终浓度为100、200、400 nmol/L时对A549细胞侵袭力的抑制率分别为55.6%、82.3%、91.2%(图2)。

　　图2 不同浓度HPSE ASODN组A549细胞穿透基底膜的侵袭细胞数(HE,×400)

　　3 讨 论

　　早在1975年Hk等就发现一种降解HS侧链的内切糖苷酶，并首次对此酶的活性进行了描述。此后，Hulett〔2〕等克隆出了人类HPSE基因序列，使相关的研究进入了新的阶段。人类HPSE基因定位于染色体4q21.3位置，cDNA全长1 758 bp，编码的活性蛋白质分子量为50 kD〔1，2〕。HPSE在正常组织中的表达主要局限于胎盘和免疫器官，而在多种恶性肿瘤中有高水平表达〔3～7〕。研究发现HPSE的表达水平与肿瘤细胞的侵袭和转移潜能密切相关。肿瘤细胞的侵袭和转移，必须突破细胞外基质和基底膜屏障。细胞外基质是由多种大分子组成的复杂网络系统，主要成分为Ⅳ型胶原、层黏连蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖由一个蛋白质核心和多条HS侧链构成。基底膜是一种特殊的细胞外基质，呈坚固的薄纸样结构。肿瘤细胞能够分泌多种降解酶，破坏细胞外基质和基底膜屏障，常见的有基质金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等蛋白酶家族成员。HPSE是一种糖苷内切酶，可在数个位点上降解HS，从而破坏细胞外基质和基底膜的完整性，促进肿瘤细胞侵袭和转移。目前的研究发现，HPSE是唯一具有降解HS活性的酶〔1〕，这使HPSE成为研究抗肿瘤转移药物的新靶点。

　　ASODN通过碱基互补原理，与目的mRNA特定序列特异性结合，形成DNARNA杂合双链，诱导内源性RNA降解酶H对mRNA链进行水解，并通过空间位阻效应阻断mRNA剪切加工、转运和蛋白质翻译合成，从而达到基因治疗的目的〔8〕。Uno等〔9〕曾将HPSE反义核酸通过腺病毒载体导入人食管癌细胞系，明显降低了其HPSE表达水平和体外侵袭能力。

　　我们针对HPSE mRNA的起始密码区设计合成了ASODN，通过硫代磷酸化修饰增强其稳定性和抗酶解能力。寡核苷酸可通过被动扩散和细胞膜受体介导的胞吞作用进入细胞。阳离子脂质体在一定比例内能够中和寡核苷酸所带的负电荷，使寡核苷酸易于通过细胞膜，提高转染率。本实验通过半定量RTPCR、流式细胞学检测和Matrigel细胞侵袭实验说明，HPSE ASODN能够在不同水平下调HPSE mRNA及其蛋白的表达，从而显著降低肺癌A549细胞的侵袭力，此抑制作用表现出明显的剂量依赖性。这表明，HPSE参与肺癌细胞的侵袭和迁移，在肺癌细胞侵袭和转移中起重要作用，HPSE可能会成为预防和治疗肺癌侵袭和转移的新靶点;通过HPSE ASODN可能为肺癌的基因治疗提供一条新的途径，可望为肺癌的基因治疗提供有意义的理论依据。

　　【参考文献】

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