不同处理对大鼠移植心脏存活时间的影响

　　作者：王维维 张光毅 作者单位：徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心，江苏徐州221002

　　【摘要】 目的 观察美金胺对SD雄性大鼠全脑缺血/再灌注后海马CA1区锥体细胞的保护作用，并研究其可能的机制。方法 采用四动脉结扎法建立大鼠全脑缺血模型，缺血15 min后分别灌注6 h或5天。大鼠随机分为假手术组、缺血/再灌注组、缺血/再灌注给药组和缺血/再灌注溶剂对照组。缺血/再灌注给药组腹腔注射20 mg/kg美金胺。使用免疫印迹、免疫沉淀和焦油紫染色法等技术检测相关信号蛋白的表达、活化水平及神经元细胞的死亡。结果 大鼠缺血/再灌注5天后，缺血/再灌注给药组海马CA1区细胞的存活数量较缺血/再灌注组和缺血/再灌注溶剂对照组明显增加;缺血/再灌注6 h，缺血/再灌注给药组N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体亚基2A (NR2A)、突触后密集区蛋白95(PSD-95)、非受体型蛋白酪氨酸激酶(Src)三者间免疫沉淀的蛋白量及NR2A的酪氨酸磷酸化水平较缺血/再灌注组和缺血/再灌注溶剂对照组明显降低，而三者的表达量没有明显变化。结论 美金胺通过抑制NR2A、PSD-95、Src三者结合及Src介导的NR2A的酪氨酸磷酸化抑制了缺血后NMDA受体功能的增强，从而对大鼠缺血性脑损伤有保护作用。

　　【关键词】 脑缺血/再灌注 美金胺 NMDA受体 NR2A Src

　　Pathological study on the neuroprotection of memantine against cerebral ischemia in SD rats

　　WANG Weiwei, ZHANG Guangyi

　　(Research Center for Biochemistry and Molecular Biology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract: Objective To evaluate the neuroprotection of memantine against cerebral ischemia in SD rat models, and investigate the underlying mechanism. Methods Rats were randomly assigned to 4 groups: sham-operation group, ischemia/reperfusion group, vehicle control group and drug test group. Transient brain ischemia (15 min) and reperfusion was induced by the four-vessel occlusion method (4-VO). The experiment was performed by using IB, IP and morphologic methods to examine the expression of relevant message proteins and the survival of hippocampal neurons. Results Transient cerebral ischemia/reperfusion induced obvious neuronal death, which could be improved by the use of memantine. It was also found that memantine inhibited the interactions between NR2A, Src and PSD-95, and decreased the tyrosine phosphorylation of NR2A. Conclusions The neuroprotective effects of memantine against cerebral ischemic/reperfusion damage are pathologically confirmed in SD rats models. And the mechanism may involve the tyrosine phosphorylation of NR2A by Src.

　　Key words: cerebral ischemia/reperfusion; memantine; NMDA receptors; NR2A; Src

　　近年来脑缺血损伤的发病机制被认为主要是N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体的兴奋毒作用。研究报道NMDA受体的非竞争性拮抗剂美金胺(memantine)可以抑制NMDA受体在病理条件下的过度增强，其作用与阻滞通道过度开放有关[1]，但其作用的具体机制仍没有充分阐明。本实验采用大鼠全脑缺血/再灌注模型研究美金胺对脑缺血的神经保护作用，并探讨其可能的作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物 清洁级雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，250～300 g，由徐州医学院实验动物中心提供。随机分为4组：假手术组(Sham)、缺血/再灌注组(ischemia/reperfusion, I/R)、缺血/再灌注溶剂对照组(Saline)、缺血/再灌注给药组(Memantine)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 动物模型制备 按本实验室已建立的大鼠四动脉结扎模型，动物以20%水合氯醛(300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉，电凝椎动脉。手术第2天动物于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，全脑缺血15 min，再灌注6 h或5天。缺血后立即给予腹腔注射药物或溶剂，以体征表现判断缺血模型的可靠性[2]。假手术组不结扎双侧颈总动脉。

　　1.2.2 给药 美金胺溶于生理盐水中，缺血/再灌注给药组在缺血后立即腹腔注射给药20 mg/kg;溶剂对照组给予等体积生理盐水。

　　1.2.3 样品制备 大鼠再灌注6 h后，断头快速取脑，分离双侧海马，沿海马裂将其CA1部分分离出来，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行：从液氮中取出海马加匀浆缓冲液，用Teflon匀浆器高速匀浆(10 s×6次)， 1 000 g于4℃离心15 min，小心移取上清液(主要为海马的胞质部分)，置-80℃冰箱待用。

　　1.2.4 蛋白浓度测定 采用改良Lowry′s法，以牛血清白蛋白(BSA, fraction Ⅴ)为标准蛋白。

　　1.2.5 免疫沉淀(immunoprecipitation, IP) 以下操作均在4℃条件下进行：含相同蛋白量(400 μg)的样品中，加入0.35 ml IP缓冲液，1～2 μg抗体anti-NR2A，旋转混匀器上反应4 h或过夜，再加入25 μl 蛋白A，旋转混匀器上反应2 h，12 000 g离心2 min，沉淀用IP缓冲液洗3遍。加入1/3体积4×蛋白上样缓冲液，混匀后置沸水浴中5 min以洗脱蛋白A上结合的蛋白，12 000 g离心2 min，吸取上清液用于免疫印迹。

　　1.2.6 免疫印迹(immunoblot, IB) 含相同蛋白量的样品中加入1/3体积4×蛋白上样缓冲液，置沸水浴中5 min变性处理。取等量的变性蛋白质样品(100 μg)或IP处理后样品，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)分离后，电转移至硝酸纤维素(NC)膜上。将NC膜置封闭液中室温孵育3 h后，分别加入一抗anti-pY、anti-NR2A、anti-PSD-95或anti-Src工作液，4℃孵育4 h或过夜，TBST洗膜(5 min×3)后，加入AP标记的二抗工作液，室温孵育2 h，TBST洗膜(3 min×5)，水洗。使用NBT/BCIP试剂盒，在新鲜配制的AP显色液中显色，流水洗涤终止反应。扫描膜上显色条带并以Quantity One 软件分析处理。

　　1.2.7 组织学检查 再灌注5天时，以水合氯醛麻醉大鼠，接着以生理盐水和4%多聚甲醛进行心室灌注，然后取脑块放于4℃下4%多聚甲醛中固定1天。 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。取海马齿状回互包段连续冠状切片，片厚5 μm,切片经脱蜡、晾干, 0.1%焦油紫(cresyl violet)染色10～20 min，梯度乙醇分色，光镜下观察神经元呈紫色而背景基本无色为止，脱水、透明、封片。显微镜下计数CA1区1 mm宽度内的存活锥体细胞。

　　1. 3 统计学处理 数据以±s表示，应用SigmaStat统计软件，采用单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 缺血/再灌注5天海马CA1区锥体细胞的存活量 光镜下可见：Sham组、Memantine组海马CA1区细胞分布均匀整齐;I/R组和Saline组出现大量死亡细胞，存活细胞较少，表现为细胞破碎、核固缩、溶解(图1)。各组大鼠脑缺血/再灌注后海马CA1区细胞存活量统计结果见表1。与I/R组相比，Memantine组存活细胞明显增加(P<0.05)。 表1 缺血/再灌注5天后各组大鼠海马CA1区锥体细胞存活数与I/R组比较：*P<0.05

　　2. 2 缺血/再灌注6 h海马CA1区NR2A、PSD-95、Src三者的结合及NR2A的酪氨酸磷酸化水平的变化 由图2、3可知，以anti-NR2A免疫沉淀，anti-pY、anti-PSD-95、anti-Src免疫印迹，在缺血/再灌注6 h，Memantine组海马CA1区NR2A、PSD-95、Src三者相互免疫沉淀蛋白量及NR2A的酪氨酸磷酸化水平较I/R组明显降低;以NR2A、PSD-95, Src三者抗体直接免疫印迹的结果各组均没有明显变化。

　　3 讨 论

　　缺血性神经细胞损伤相当一部分是由谷氨酸受体中的NMDA受体的过度活化介导的，它的活化引起通过膜受体离子通道内流的Ca2+大量增加，导致神经元死亡。而NMDA受体功能受到Src激酶介导的受体亚基NR2A的酪氨酸磷酸化水平的调节[3]。然而，NMDA受体的生理性活化状态对于正常神经元的功能也非常重要。这就意味着那些完全抑制NMDA受体活性的具潜在神经保护作用的药物极有可能在临床上产生不可耐受的副作用[4]。

　　而金刚胺的衍生物美金胺，作为一种非竞争性、低亲和力、开放性的通道阻滞剂，优先抑制NMDA受体的过度活化，而不影响正常的受体活性。当受体离子通道过度开放时，它优先进入通道;更重要的是，它的解离速率快，不会持续积聚在通道上干扰随后正常的突触传递，理论上应用相对安全[5]。有报道美金胺对脑缺血缺氧损伤和其他多种神经损伤都具有脑保护作用[1]，比如阿尔茨海默病和血管性痴呆[4]。它作为抗帕金森病的新药近年来在欧洲广泛应用，罕见副作用的报道[6-7]。

　　同时，脑缺血方面的研究证实美金胺对新生鼠缺血缺氧性脑损伤[8]具有神经保护作用，并且对实验动物的认知能力没有产生明显副作用[9]。已知在脑缺血/再灌注6 h，NMDA受体亚基NR2A、PSD-95、Src三者结合增加，NR2A的酪氨酸磷酸化水平增加[10]，从而上调NMDA受体的功能，导致Ca2+内流增加，最终引起神经元的死亡。本实验中，我们在诱导全脑缺血后立即给予美金胺，通过免疫沉淀和免疫印迹结果显示美金胺能够抑制缺血/再灌注6 h NR2A、PSD-95、Src三者的结合及NR2A酪氨酸磷酸化的增加，提示其抑制了缺血后NMDA受体的功能。而焦油紫染色结果也显示美金胺明显减少了再灌注5天后海马CA1区锥体细胞的死亡，证明在全脑缺血发生后立即给予美金胺使NR2A的酪氨酸磷酸化减少，抑制了NMDA受体的功能，拮抗了NMDA受体的过度激活，从而对神经细胞具有保护作用。在全脑缺血损伤发生后给予美金胺对神经细胞仍然具有保护作用，与缺血前给药的方式[11]相比，增加临床治疗措施的可行性。本研究结果为我们进一步阐述美金胺脑缺血保护作用及其临床应用提供了一定的依据。

　　【参考文献】

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　　[9] Chen HS, Wang YF, Rayudu PV, et al. Neuroprotective concentrations of the N-methyl-D-aspartate open-channel blocker memantine are effective without cytoplasmic vacuolation following post-ischemic administration and do not block maze learning or long-term potentiation [J]. Neuroscience, 1998, 86 (4): 1121-1132.

　　[10] Liu Y, Zhang G, Gao C, et al. NMDA receptor activation results in tyrosine phosphorylation of NMDA receptor subunit 2A(NR2A) and interaction of Pyk2 and Src with NR2A after transient cerebral ischemia and reperfusion [J]. Brain Res, 2001,909(1-2): 51-58.

　　[11] Block F, Schwarz M. Memantine reduces functional and morphological consequences induced by global ischemia in rats [J]. Neurosci Lett, 1996, 208(1): 41-44.