非小细胞肺癌患者血清及癌组织中P185neu的定量检测

　　作者：李新举，梁景仁，关正，袁育康，张智慧 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院胸外科，陕西西安 710061;西安交通大学医学院免疫学与病原生物学系，陕西西安 710061;四川省肿瘤医院肿瘤内科，四川成都 610041)

　　【摘要】 目的 探讨P185neu蛋白的定量水平与非小细胞肺癌(NSCLC)患者的临床生物学行为及预后的关系。方法 采用双抗体夹心ELISA法定量检测了37例NSCLC患者及17例良性肺疾病和健康对照者血清和组织中P185neu 的蛋白水平。结果 37例NSCLC患者血清和癌组织中P185neu 的蛋白水平明显升高(P<0.01)，且P185neu 蛋白水平与NSCLC细胞分化程度、TNM分期及淋巴结转移呈显著正相关(P<0.05)。另外，NSCLC患者术前血清P185neu 的蛋白水平明显高于术后10天的血清水平(P<0.01)。结论 P185neu 的蛋白水平与NSCLC的发生、发展和转移密切相关;血清P185neu蛋白水平可作为评估NSCLC进展、复发和预后的有效指标。

　　【关键词】 肺癌;P185neu 蛋白;双抗体夹心ELISA法

　　Determination of P185neu level in serum and　tumour tissue of nonsmall cell lung cancer

　　Li Xinju, Liang Jingren, Guan Zheng, Yuan Yukang, Zhang Zhihui

　　(Department of Thoracic Surgery, the First Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University, Xian 710061; Department of Immunology and　Microbiology, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061;Department of Oncology, Oncological Hospital of Sichuan Province, Chengdu 610041, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate the relation between the level of P185neu in serum and tumour tissue and clinical biological behaviour of nonsmall cell lung cancer (NSCLC). Methods By ELISA method, 37 specimens of sera and tumour tissues of nonsmall cell lung cancer were examined, and 17 cases of adjacent nonneoplastic tissues and sera were examined for the level of P185neu protein. Results Of the 37 NSCLC cases, the level of P185neu in sera and tumour tissues was higher (P<0.01). The level of P185neu was positively related to cell differentiation, TNM stages, and lymph node metastasis (P<0.05). The preoperative serum level of P185neu was significantly higher than the postoperative serum level (P<0.01). Conclusion P185neu may play an important role in tumor progression and malignant potential of nonsmall cell lung cancer, and the level of serum P185neu could be of prognostic significance.

　　KEY WORDS: lung cancer; P185neu ; BAELISA

　　近年来，随着分子生物学和遗传学研究的深入，人们试图用分子手段进行预防、诊断和治疗肺癌。CerbB2基因是Semba等于1985年发现的一种原癌基因，其表达产物P185neu蛋白是一种具有酪氨酸激酶活性的糖蛋白，被异常激活后可导致细胞增殖、癌变。大量研究显示，非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)组织中存在P185neu蛋白过度表达。但是，其在非小细胞肺癌患者血清中的含量少见报道，在非小细胞肺癌组织中的含量未见报道。因此，本研究采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(enzymelinked immunosorbentassay, ELISA)对非小细胞肺癌患者手术前、后血清及癌组织中P185neu的含量进行了定量检测，以观察P185neu在非小细胞肺癌组织和血清中的含量及与肺癌临床病理特征的关系，为临床肺癌的诊断及治疗提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 选择2005年8月至2006年1月在西安交通大学医学院第一附属医院胸外科行非小细胞肺癌手术治疗、无肝炎、糖尿病以及免疫系统疾病等合并症的患者37例，其中男25例，女12例，年龄45-70(平均57.78)岁;鳞癌21例，腺癌16例。病理分期(pTNM)：Ⅰ期与Ⅱ期20例，Ⅲ期10例，Ⅳ期7例。另外，选择健康志愿者10例和肺良性病患者7例作为对照组。

　　1.2 试剂及方法 采用双抗体夹心ELISA法。抗P185neu单克隆抗体(包被抗体)，P185neu标准品及辣根过氧化物酶标记的P185neu多克隆抗体(酶标抗体)均由四川省肿瘤医院肿瘤内科张智慧教授提供。96孔酶标硬板购自武汉博士德生物工程有限公司。包被缓冲液、酶结合抗体缓冲液、匀浆介质、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、考马斯亮兰G250染料均由西安交通大学医学院免疫学与病原生物学系提供。底物显色液及反应终止液由深圳晶美生物工程有限公司生产。抽取良性病例组及肺癌病例组术前1d、术后3d及术后10d清晨空腹静脉血2mL，分离血清，低温(-80℃)冻存待检。另外，良性病例组及肺癌病例组均于手术当日切取病变组织，称重后放入液氮中冻藏，随后制作组织匀浆，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定组织匀浆中的P185neu含量。

　　1.3 结果判断 根据P185neu标准品的不同浓度及其对应的吸光度(A值)制作标准曲线，计算回归方程，得出P185neu浓度与吸光度之间的直线方程，再根据样本的吸光度，利用回归方程计算出样本中P185neu的浓度。血清样本中P185neu浓度再乘以稀释倍数，得出最终结果，单位为ng/mL。组织匀浆样本中P185neu浓度再除以各组织匀浆样本总蛋白的浓度，得出单位重量组织匀浆样本中P185neu的浓度，单位为ng/mg protein。

　　1.4 统计学处理 用SPSS10.0软件包进行统计学处理。每组数据均采用±s表示，统计学分析采用t检验，分组比较采用方差分析，两两比较采用q检验及相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 NSCLC组、良性病例及健康对照组术前血清中的P185neu含量的比较 NSCLC组、良性病例及健康对照组术前血清中P185neu含量分别为(8.95±1.59)ng/mL，(6.51±0.54)ng/mL，(6.16±0.56)ng/mL，单因素方差分析显示三组之间P185neu的含量存在显著性差异(F=20.882, P<0.01);两两比较分析，NSCLC组P185neu含量明显高于良性病例组及健康对照组(P=0.001)，良性病例组与健康对照组之间无显著性差异(P=0.217)。

　　2.2 NSCLC组和良性病例组癌组织匀浆中P185neu含量的比较 NSCLC组和良性病例组组织匀浆中P185neu的含量分别为(16.86±2.79)ng/mg protein，(10.27±0.94)ng/mg protein，独立样本t检验显示P185neu的含量具有显著性差异(t=6.04，P<0.01)，NSCLC组显著高于良性病例组。

　　2.3 NSCLC患者术前血清及癌组织匀浆中P185neu含量与肺癌病理特征的关系 NSCLC患者术前血清中P185neu含量与有无淋巴结转移、肿瘤大小、细胞分化程度及TNM分期之间有显著性差异(P<0.05)。NSCLC癌组织匀浆中P185neu含量与有无淋巴结转移、细胞分化程度及TNM分期之间有显著性差异(P<0.05，表1)。

　　表1 NSCLC患者术前血清及癌组织匀浆中P185neu含量与肺癌病理特征的关系(略)

　　Table 1 The relationship between P185neu level in preoperative serum and tumour tissues and pathology feature of NSCLC

　　*P<0.05,**P<0.01 vs. N0 LN; #P<0.05 vs. T1+T2 size; △P<0.05 vs. Ⅰ degree; ▲P<0.05,▲▲P<0.01 vs. Ⅰ+Ⅱ stage

　　2.4 NSCLC和肺良性病患者术前及术后血清中P185neu含量的动态变化 NSCLC患者术前1d、术后3d及术后10d血清中P185neu含量分别为(8.95±1.59)ng/mL，(9.11±1.95)ng/mL，(8.05±1.82)ng/mL，经两因素方差分析，术前1d及术后3d血清中P185neu的含量显著高于术后10d的含量(F=11.34，P<0.05)，术前1d与术后3d相比无显著性差异(P=0.635)。但经单因素方差分析，术后10d血清中P185neu含量与良性病例组及健康对照组血清中P185neu的含量之间仍存在显著性差异(F=4.96，P=0.013，图1)。

　　图1 NSCLC患者术前、术后血清中P185neu含量的比较(略)

　　Fig.1 Comparison of P185neu level in preoperative and postoperative serum in patient with NSCLC

　　2.5 NSCLC患者术前血清中P185neu含量与癌组织匀浆中P185neu含量的相关性 通过相关性分析，NSCLC患者术前血清中P185neu的含量与肺癌组织匀浆中P185neu的含量具有相关性，其相关系数为0.793(P<0.01)，说明两者之间呈正相关。

　　3 讨论

　　现已证明，癌的发生是以多个癌基因激活和抑癌基因失活为基础的多步骤多阶段的过程。只有在致癌因素的刺激下，原癌基因结构和调控发生异常而激活，以致其编码蛋白表达增加，才使细胞分裂失控并最终导致恶变。原癌基因CerbB2定位于人染色体17q21，编码产物P185neu蛋白为具有酪氨酸激酶活性的细胞膜受体，参与调节细胞的生长、分化和分裂，在细胞增殖和分化调控中起重要作用。自从Slamon等报道CerbB2癌基因的扩增和(或)过度表达与乳腺癌发生、发展及预后的关系后，激起了人们对CerbB2癌基因及其表达产物研究的极大兴趣。BrandtRauf等[1]发现P185neu蛋白的胞外区域可从肺腺癌细胞脱落入血, 并可在患者血清或血浆中用ELISA法检测出来，其升高也有着和组织中P185neu过度表达相类似的临床意义。本实验应用BAELISA法，对NSCLC患者血清及肿瘤组织匀浆中P185neu含量进行检测，发现术前血清中P185neu含量与癌组织匀浆中P185neu含量呈高度正相关(r=0.784，P<0.01);对肺良性病变术前血清及组织匀浆和正常人血清中P185neu含量进行相关性分析，发现两者均存在P185neu蛋白表达但无相关性(r=0.67, P=0.10)。说明P185neu在肺良性病变及正常人组织中均存在微量表达，且其表达为随机性;而NSCLC患者血清中P185neu含量的升高是由于癌组织中P185neu蛋白表达升高引起的。因此，NSCLC患者血清中P185neu含量的检测可间接反映癌组织中P185neu的表达状况。

　　NSCLC患者术前1d及术后3d血清P185neu水平显著高于术后10d的水平(P<0.05)，术前1d与术后3d相比无显著性差异(P=0.635)。上述结果表明，在行非小细胞肺癌根治性切除术切除了原发肿瘤、受侵的周围组织以及转移淋巴结后，消除了P185neu蛋白的来源，故术后血清中P185neu蛋白含量第10天明显下降。因为目前尚无P185neu蛋白半衰期的研究报道，故推测术后3d P185neu蛋白含量与术前无显著性差异可能与P185neu蛋白半衰期有关。癌细胞从原发灶脱落进入血循环播散，是非小细胞肺癌发生发展过程中的一个早期事件。研究表明，在淋巴结尚未转移的Ⅰ期NSCLC中，约30%-50%的患者已存在骨髓和血循环隐匿性癌细胞的播散[2]。NSCLC患者术后第10天血清中P185neu含量较术前显著降低，但仍高于健康对照组及良性病例组，考虑其除与P185neu蛋白半衰期有关外，亦与脱落入血的癌细胞释放P185neu蛋白有关。

　　本实验结果还显示，在伴有肺门及(或)纵隔淋巴结转移的NSCLC患者术前血清中P185neu含量为(9.74±0.75ng/mL)，与无淋巴结转移组相比(7.71±1.79ng/mL)存在显著性差异(P=0.004)。发生淋巴转移的NSCLC患者血清中P185neu蛋白水平明显高于未发生淋巴转移者。说明P185neu蛋白过度表达与NSCLC淋巴转移密切相关。NSCLC患者临床TNM分期越晚、细胞分化越差，肿瘤体积越大，血清中P185neu含量就越高，差异有显著性(P<0.01)。说明P185neu水平越高，其肺癌进展越快，预后越差。主要原因：①细胞表面过度表达的P185neu对生长因子或其他激素类因子具有超常的敏感性，从而促使细胞迅速生长。而快速生长的细胞失去了分化成熟的能力，逐渐发生恶性转变。恶性转变后的细胞表达出更多的P185neu，进一步促进癌细胞的转移。Jeffrey [3]通过分子生物学的方法证实了这一观点：在转移淋巴结中CerbB2基因扩增的倍数高于原发灶，转移的癌细胞比原发灶癌细胞有更高的生长能力。而Yu DH [4]的研究也进一步表明P185neu促进转移及浸润的机理是细胞表面的P185neu定位于细胞的微绒毛及伪足，它与一种分子量为50000的蛋白结合后，使细胞的运动能力大大提高，从而为细胞的转移和浸润提供了动力。②大量活化的P185neu引起体内纤维溶酶原激活物(activator of plasminogen，AP)增加，AP激活纤维蛋白溶酶原使之转化为纤维蛋白溶酶，后者可水解纤维粘连蛋白，使细胞间的相互粘着力下降，从而有利于肿瘤细胞的脱落和转移。③一般认为，癌细胞浸润转移的过程包括癌细胞的脱落、癌细胞与基底膜的紧密附着、细胞外基质的降解和癌细胞的移出。P185neu过表达影响某些黏附分子如上皮细胞钙粘蛋白(Ecadherin)等合成，从而使癌细胞彼此离散，以便于进一步在基底膜附着;④P185neu通过某种分子途径激活了癌细胞内基底膜分解酶，如胶原酶Ⅳ的活性。该酶是一种基质金属蛋白酶，能分解上皮和血管基底膜的Ⅳ型胶原纤维，使基底膜产生局部的缺损，便于癌细胞通过并重复上述过程，从而加强了转移信号或促进了转移信号的转导，促进了癌细胞的转移。Hirsch等[5]以及Selvaggi 等[6]报道肺腺癌原发灶为T3、T4的患者P185neu的阳性表达率高于T1、T2的患者;Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的患者P185neu的阳性表达率高于Ⅰ期的患者;细胞分化差的NSCLC的患者CerbB2基因的表达(80.9%)明显高于分化好者(32.4%)(P<0.01)，周围型明显高于中央型(P<0.05)。推测CerbB2基因表达与肺癌细胞分化受抑及病变进展亦有关，P185neu表达水平越高，其细胞分化程度越低、恶性度越高。结合本研究结果，说明P185neu高表达与肺癌的恶性生物学行为密切相关[78]。

　　【参考文献】

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　　[2]Osaki T, Mitsudomi T, Oyama T, et al. Serum level and tissue expression of cerbB2 protein in lung adenocarcinoma [J]. Chest, 1995, 108(1):157162.

　　[3]Jeffrey AK, Schwartz DA，Nordberg JE, et al. P185 expression in human lung adenocarinomas predicts shortened survival [J]. Cancer Res, 1990, 50(16): 51845191.

　　[4]Yu DH, Wang SS, Dulski KM, et al. cerbB2/neu overexpression enhances metastatic potential of human lung cancer cells by induction of metastasisassociated properties [J]. Cancer Res, 1994, 54(12): 32603266.

　　[5]Hirsch FR, VarellaGarcia M, Franklin WA, et al. Evaluation of HER2/neu gene a mplification and protein expression in nonsmall cell lung carcinomas [J]. Br J Cancer, 2002, 86(9):14491456.

　　[6]Selvaggi G, Seagliotti GV, Torri V, et al. HER2/neu overexpression in patients with radically resected non small cell lung carcinoma. Impact on longterm survival [J]. Cancer, 2002, 94(10):26692674.

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