银杏叶提取物抗大鼠肺缺血/再灌注损伤的实验研究

　　作者：周中新 作者单位：徐州医学院第二附属医院心胸外科，江苏徐州221006

　　【摘要】 探讨银杏叶提取物(EGb761) 能否通过诱导血红素氧合酶-1(HO-1)活性减轻肺缺血/再灌注损伤。方法 采用呼气末无创血管夹夹闭阻断左主支气管、左肺动脉和左肺静脉30 min后再灌注2 h建立缺血/再灌注(I/R)动物模型。40只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为4组：假手术组、I/R组、EGb组(术前24 h腹腔注射EGb 20 mg/kg)、EGb+ZnPP组(EGb 20 mg/kg +再灌注前15 min静脉注射ZnPP Ⅸ 40 μmol/kg)，检测肺湿重/干重比、肺泡损伤数、肺组织中HO-1的活性和肺组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Pxase)活性变化。结果 ①EGb761明显诱导肺组织HO-1活性增加(P<0.01);②同假手术组比较，I/R组肺湿重/干重比及肺泡损伤数增加(P<0.01)，肺组织GSH-Pxase活性降低(P<0.01)，缺血/再灌注前用EGb761可逆转上述病理改变(P<0.01)，用HO-1的抑制剂ZnPP Ⅸ可部分抑制EGb761的保护作用。结论 EGb761通过HO-1的抗氧化作用减轻肺缺血/再灌注损伤。

　　【关键词】 银杏叶提取物 血红素氧合酶-1 缺血 再灌注损伤 肺 鼠

　　Protective effect of extract of Ginkgo biloba against lung

　　ischemia-reperfusion injury in rats

　　ZHOU Zhongxin, HUANG Jijiang, CHU Wei, QIU Zhongjin, ZENG Wanli

　　(Department of Thoracocardiac Surgery, the Second Affiliated Hospital of

　　Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221006, China)

　　Abstract: Objective To investigate whether the extract of Ginkgo biloba (EGb761) could attenuate the lung ischemia-reperfusion (I/R) injury by inducing the activation of heme oxygenase-1 (HO-1) in rats. Methods The lung I/R model was established by ligaturing the left lung hilum for 30 min followed by reperfusion for 120 min in the rats. 40 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups: sham operation group, I/ R group, EGb761 group and EGb+zinc-protoporphyrin-IX (ZnPP Ⅸ) group. The pretreatment with EGb 20 mg/ kg ip and with ZnPP Ⅸ 40 μmol/ kg iv was administered 24 h and 15 min before I/R respectively. The HO-1 activity and GSH-Pxase activity in lung tissue, the lung wet-to-dry weight (W/D) ratio and the number of injured alveoli were determined. Results ①Compared with I/R group, the HO-1 activity was increased markedly in EGb761 group (P<0.01). ②Compared with the sham operation group, the W/D ratio and the number of injured alveoli were significantly increased in the I/R group (P<0.01), but the GSH-Pxase activity was decreased (P<0.01). Pretreatment with EGb761 before I/R could reverse the above changes, likely through the activation of HO-1， which was, in the present study, partially suppressed by ZnPP Ⅸ, an HO-1 inhibitor. Conclusion EGb761 can ameliorate lung I/R injury in rats significantly by activating the HO-1 in lung tissue.

　　Key words： extract of Ginkgo biloba; heme oxygenase -1; ischemia/reperfusion injury; lung; rats

　　近年来，随着心脏手术、器官移植、心肺脑复苏措施的深入开展，体外循环技术在临床上的应用日益增多，对肺缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤，及其所导致的肺功能障碍的发生和防治也逐渐被人们重视。EGb761是从银杏科植物叶子经多步骤分离、纯化获得的一种混合物，成分十分复杂，其主要有效成分为黄酮糖苷类(24%)和萜烯内酯类(6%)。现初步已知，抗氧化作用是EGb的主要药理作用之一。大量体外试验表明，EGb中黄酮类化合物能清除自由基，银杏内酯B(ginkgolinde B，GB)和白果内酯(BB)也有清除自由基的作用[1]。新近研究发现，银杏叶提取物可诱导培养的心肌细胞、神经元和缺血的肾组织表达血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)，并使其活性增加[2-3]。血红素氧合酶-1是一种降解血红素为一氧化碳(carbon monoxide，CO)、铁(Fe)和胆红素的起始酶和限速酶，除了具有降解血红素的功能外，还具有抗炎、抗凋亡、抗氧自由基等多种生理调节功能。近年来的研究表明，HO-1的活性诱导具有抗肺缺血/再灌注损伤的作用[4]。

　　本实验拟采用大鼠肺“在体暖缺血/再灌注”模型，通过测定肺湿重/干重比及肺泡损伤数、肺组织中HO-1的活性和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Pxase)活性变化，观察EGb761对HO-1活性和肺组织损伤的影响，探讨EGb761对肺缺血/再灌注损伤的防治作用和可能的机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物和试剂 健康Sprague-Dawley大鼠，40只，体重250～300 g，清洁级，由徐州医学院实验动物中心提供。EGb761(金纳多，Ginato)由德国威玛舒培大药厂生产，锌原卟林Ⅸ(ZnPP Ⅸ)为ICN公司产品，HO-1和GSH-Pxase检测试剂盒由南京建成生化试剂公司提供。

　　1.2 大鼠肺缺血/再灌注模型的建立

　　1.2.1 模型制备 大鼠20%水合氯醛300～350 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰卧位固定。行颈部正中切口，分离出气管、右侧颈静脉和颈动脉，气管切开、插管，接动物呼吸机行机械通气(吸入室内空气，呼吸频率40次/ min，潮气量10～15 ml/kg)，右侧颈静脉插管、固定，接微量注射泵;然后经左侧第5肋间开胸，游离左肺门，静脉注射肝素100 U。静息5 min后，于呼气末用无创血管夹夹闭阻断左主支气管、左肺动脉和左肺静脉。30 min后开放，进行再灌注2 h。

　　1.2.2 动物分组及处理 40只大鼠随机分为4组，每组10只:①假手术对照(Sham)组，不阻断肺门;②肺缺血/再灌注(I/R)组;③EGb组，手术前24 h腹腔注射EGb761(5 ml/支，每支含银杏叶提取物17.5 mg，银杏黄酮苷4.2 mg)20 mg/kg，其余步骤同I/R 组;④EGb+ZnPP组，再灌注前15 min静脉注射ZnPPⅨ(40 μmol/ kg)，其余步骤同EGb组。再灌注2 h后处死大鼠。

　　1.3 检测指标及方法

　　1.3.1 肺湿重/干重比测定及肺泡损伤数测定 取部分肺组织生理盐水充分漂洗，滤纸吸干，称重为湿重，70℃、24 h烘干称重为干重，两者之比为肺湿重/干重比。肺组织经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色，显微镜下200倍视野连续观察200个肺泡，计数内含红细胞和白细胞超过2个以上的肺泡(视为损伤肺泡)，然后计算出损伤肺泡的百分数，作为肺泡损伤的定量评价指标。

　　1.3.2 HO-1活性测定 根据HO-1降解血红素生成胆红素和CO原理，测定样品反应物中胆红素生成量代表HO-1活性。取肺组织，用0.1 mol/L KH2PO4冷缓冲液(pH 7.4)充分漂洗后，加4倍容积的同种缓冲液，匀浆后低温(4℃)、高速离心15 min(15000 r/min)，去除脂层，收集上清液。-70℃保存的肺匀浆上清液20 μl，加入2 mmol/L正铁血红素40 μl、415 mmol/L NADPH 40 μl，置37℃暗处10 min，之后将反应物置于冰上以终止反应。以不含NADPH的样品作空白对照，样品与空白对照均做双份，在722型分光光度计上用464 nm和530 nm双波长测定胆红素生成量，胆红素摩尔吸光系数为40 mmol/(L·cm)。计算单位蛋白质中HO-1活性。蛋白质含量测定用考马斯亮蓝法。

　　1.3.3 肺组织GSH-Pxase活性测定 取肺组织，用含有0.16 g/L heparin的生理盐水灌流清除血液后，冰冷生理盐水中洗去浮血，按照约每20 mg组织加入200 μl匀浆液的比例，制备匀浆，4℃、12000 g离心10 min，取上清按照试剂盒说明通过紫外比色法测定GSH-Pxose酶活性。计算单位蛋白质中GSH-Pxase酶活性。以牛血清白蛋白为标准品，用Lowry法测定各样品中蛋白质含量。

　　1.4 统计学处理 数据经SAS统计软件处理，以±s表示，各组间均数的两两比较用q检验。P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 肺湿重/干重比和肺泡损伤数 见表1。表1 4组肺湿重/干重比和肺泡损伤数比较

　　2.2 HO-1活性测定 见表2。表2 4组HO-1活性比较

　　2.3 GSH-Pxase活性测定 见表3。表3 4组肺组织GSH-Pxase活性比较

　　3 讨 论

　　本实验结果显示，EGb761可明显降低肺缺血30 min再灌注2 h后肺湿重/干重比和肺泡损伤数，说明EGb761对肺缺血/再灌注损伤有保护作用。有研究表明[5]，肺缺血/再灌注0.5 h即表现出明显的再灌注损伤，再灌2 h肺泡损伤数达到高峰。大鼠肺缺血/再灌注后，由于大量自由基产生，导致膜脂质发生过氧化，破坏了膜脂质的代谢和结构，从而改变酶蛋白的微环境。另一方面，自由基也可直接氧化酶蛋白氨基酸残基，引起酶蛋白构象改变，使酶失活。GSH-Pxase在细胞质中直接参与清除H2O2 ，易受氧自由基O+2攻击而失活。本结果证实，大鼠肺缺血/再灌注后GSH-Pxase活性明显低于正常(P<0.01)。有研究表明[6]，银杏叶提取物中的黄酮苷类化合物是O+2捕捉剂和O+2淬灭剂，参与清除超氧阴离子、抑制脂质过氧化反应，银杏内酯B和白果内酯也有清除自由基的作用。本结果也显示，EGb761(20 mg/kg)处理组的GSH-Pxase活性显著高于缺血/再灌注组(P<0.01)。提示自由基参与了肺缺血/再灌注早期肺泡细胞的损伤，EGb761通过抑制脂质过氧化反应而保护肺缺血/再灌注损伤。

　　HO-1是血红素降解过程中的限速酶，可被各种应激状态包括缺血/再灌注所诱导。近年来发现，它除了具有降解血红素的功能外，还具有多种生理调节功能，例如抗炎、抗凋亡、抗氧自由基等。本科研组以前研究表明，HO-1活性诱导后可有效阻止氧化应激引起的肺缺血/再灌注损伤[7]。本组实验结果显示，缺血/再灌注可诱导HO-1的活性，而EGb761预处理后，HO-1的活性被显著诱导，相应的肺缺血/再灌注导致的肺泡损伤数减少。由此推测，EGb761保护肺缺血/再灌损伤可能与其对HO-1活性的诱导有关。为证实这一推测，在给予EGb761的同时又注射HO-1的特异性抑制剂ZnPP Ⅸ用于阻断HO-1的作用，结果EGb761对肺缺血/再灌注损伤的保护作用被抑制，从而证实EGb761是通过对HO-1的活性诱导而保护肺缺血/再灌注损伤的。

　　EGb761诱导HO-1的活性而保护肺缺血/再灌注损伤的机制可能与HO-1具有的多种抗氧化活性有关。HO-1可降解血红素，游离血红素本身是一种强力促氧化剂，可导致活性氧的产生，活性氧的产生又可诱导含血红素蛋白裂解出更多的血红素，由此形成恶性循环。因此，HO-1的活性诱导，可加速清除肺内游离血红素，减少活性氧的产生。在血红素氧化酶代谢产物中，胆红素是一种较强的内源性抗氧化物质，能清除再灌注时产生的氧自由基，减轻细胞膜脂质过氧化损伤[8];此外，Fe2+作为HO-1的代谢产物，能诱导铁结合蛋白的生成，后者可增加对缺血/再灌注期间产生过多游离Fe2+的结合，减少由Fe2+所介导的氧自由基的生成[9]。本实验观察到EGb组大鼠肺内HO-1的活性被显著诱导，肺组织中总抗氧化能力增强，GSH-Pxase活性显著升高，进一步同时给予HO-1的特异性抑制剂ZnPP Ⅸ则导致GSH-Pxase活性再次降低，表明EGb761通过HO-1的抗氧化作用减轻肺缺血/再灌注损伤。

　　实验中还观察到，肺湿重/干重比和肺泡损伤数在EGb+ZnPP组虽较EGb组升高，但这些指标仍低于I/R组，表明ZnPP Ⅸ抑制HO-1活性并未完全阻断EGb的保护作用，推测EGb761抗肺缺血/再灌注损伤还有其他机制参与，有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] Scholtyssek H， Damerau W， Wessel R， et al. Antioxidative activity of ginkgolides against superoxide in an aprotic environment [J]. Chem Biol Interact，1997，106(3):183-190.

　　[2] Chen JX， Zeng H， Chen X， et al. Induction of heme oxygenase-1 by Ginkgo biloba extract but not its terpenoids partially mediated its protective effect against lysophosphatidylcholine-induced damage [J]. Pharmacol Res，2001;43(1):63-69.

　　[3] Zhuang H， Pin S， Christen Y， et al. Induction of heme oxygenase-1 by Ginkgo biloba in neuronal cultures and potential implications in ischemia [J]. Cell Mol Biol，2002，48(6):647-653.

　　[4] 周伟斌，王万铁，徐正礻介，等.肺缺血再灌注损伤时血红素氧合酶-1的变化及意义[J].温州医学院学报，2004，34(2):94-96.

　　[5] 张 赛，陈如坤，林 敏，等.大鼠肺缺血再灌注损伤中肺泡细胞凋亡的动态观察[J].中华医学杂志，2004，84(19):1597-1600.

　　[6] 张明艳，王亚龙，史小琴.银杏叶提取物的实验研究现状[J].中国自然医学杂志，2004，6(4)：274-276.

　　[7] 贾晓民，周中新，黄继江，等.血红素氧合酶-1的诱导对肺缺血再灌注损伤的保护作用[J].中华医学杂志，2007，87(17):1211-1213.

　　[8] Ryter SW， Morse D， Choi AM. Carbon monoxide and bilirubin: potential therapies for pulmonary/vascular injury and disease [J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2007，36(2):175-182.

　　[9] Agarwal A， Nick HS. Renal response to tissue injury: lessons from heme oxygenase-1 GeneAblation and expression [J]. J Am Soc Nephrol，2000，11(5):965-673.