8BrcAMP联合顺铂作用于肺腺癌细胞A549的初步研究

　　作者：陈曦1,刘志勇1,2 作者单位：(1. 东南大学 临床医学院，江苏 南京 210009; 2. 东南大学附属中大医院 胸心外科，江苏 南京 210009)

　　【摘要】 目的：观察8溴环腺苷酸(8BrcAMP)联合顺铂(DDP)对人肺腺癌细胞A549生长及其表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响。方法：MTT法测定不同浓度8BrcAMP、DDP以及两药联用处理人肺腺癌细胞A549后细胞增殖活性的差异;应用RTPCR技术检测EGFR mRNA表达水平的变化;Western blot技术检测EGFR蛋白表达水平的变化;利用流式细胞术测定细胞周期的改变。结果：8BrcAMP及DDP均能抑制人肺腺癌细胞A549的增殖,并呈浓度及时间依赖性;DDP联合8BrcAMP细胞抑制率显著高于相应浓度单药组(P<0.05),两者呈现出相加的抗瘤效果。8BrcAMP可下调人肺腺癌A549细胞EGFR mRNA和蛋白的表达。8BrcAMP将细胞周期阻滞在G2/M期(P<0.05)。结论：8BrcAMP、DDP均可抑制A549细胞增殖。8BrcAMP可显著提高顺铂的细胞毒作用，增强化疗效果，并将细胞阻滞于G2/M期。8BrcAMP可以下调EGFR表达，可一定程度地逆转化癌细胞。

　　【关键词】 8溴环腺苷酸; 肺腺癌细胞A549; 表皮生长因子受体; 蛋白激酶A

　　Synergistic effect of 8BrcAMP and cisplatin in human pulmonary

　　adenocarcinoma cell A549

　　CHEN Xi1,LIU Zhiyong1,2(1. School of Clinical Medicine, Southeast University, Nanjing 210009, China; 2. Department of Cardiothoracic Surgery,

　　Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China )

　　[Abstract] Objective： To study the effect of 8BrcAMP with cisplatin(DDP) on human pulmonary adenocarcinoma cell A549 growth and the expression level of EGFR in vitro. Methods： Proliferation ability and cell cycle changes of A549 cells were detected by MTT method and flow cytometry. The mRNA levels of EGFR were determined by RTPCR. The protein expression of EGFR were valued by Western blot. Results： Both DDP and 8BrcAMP could inhibit the proliferation of A549 cells in vitro by a timeand dosedependent manner. Compared with either 8BrcAMP or DDP alone, combining 8BrcAMP at 15 μmol·L-1 with DDP at 0.5 μg·ml-1,1 μg·ml-1,2 μg·ml-1,4 μg·ml-1 respectively increased the growth inhibition rate of A549 cells significantly(P<0.05). These results suggested additive actions of the two drugs. A549 cells showed G2/M stage arrest after 8BrcAMP administration(P<0.05). Compared with the control group， expression of EGFR mRNA and EGFR protein significantly decreased in the 8BrcAMP group and combining 8BrcAMP with DDP group. Conclusions: Both DDP and 8BrcAMP could inhibit the proliferation of lung cancer cells in vitro. 8BrcAMP has also shown synergistic antitumor effects when combined with DDP. 8BrcAMP can decrease the expression of EGFR and block the cell cycle at G2/M stage.

　　[Key words] 8BrcAMP; pulmonary adenocarcinma cell; epidermal growth factor receptor; protein kinases A

　　蛋白激酶A(protein kinases A, PKA)又称cAMP依赖性蛋白激酶，是cAMP的主要调节分子。目前已知PKA根据其调节亚基不同可以分为两型，分别为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型PKA在癌细胞系、原发性肿瘤和增生过度的细胞中呈过度表达。Ⅱ型PKA主要在正常非增生性组织和生长阻滞细胞中过度表达。8BrcAMP能够选择性调节PKA，具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞分化的能力。顺铂(DDP)属于基因毒性药物，是临床上常用的广谱抗癌药物,它可直接破坏DNA,是许多肿瘤化疗的主要药物之一。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)及其配体是细胞信号转导系统的一部分，在肿瘤的形成和发展过程中占重要地位。本实验观察选择性PKA调节剂8BrcAMP与基因毒性药物DDP对肺腺癌A549细胞增殖、细胞周期以及细胞EGFR表达的影响，以期为针对PKA的肺癌靶向治疗提供一定的实验证据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　人肺腺癌细胞株A549购自中国科学院上海细胞生物研究所。主要试剂有8BrcAMP(Sigma公司)、DDP(山东齐鲁制药厂)、RPMI1640培养液(GIBCO公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、MTT(GIBCO公司)、DMSO(Sigma公司)、Trizol(Invitrogen公司)、逆转录试剂盒(Promega公司)、Taq酶(TaKaRa公司)、Western blot试剂盒(南京金思特公司)、鼠抗人EGFR抗体(Cell Signaling公司)。PCR引物由上海生工生物公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 A549细胞用含10%的胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 kU·L-1链霉素的RPMI1640培养液，在体积分数为0.05的CO2、37 ℃、饱和湿度的条件下培养。

　　1.2.2 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖 细胞以每孔5×103·(100 μl)-1接种于96孔板，在含10%小牛血清的RPMI1640培养液中培养24 h，换为无血清培养基，24 h细胞同步化后加入含不同浓度8BrcAMP、DDP及两者联合的培养基，对照组加等量培养基。8BrcAMP设4个浓度组，分别为10、15、20、25 μmol·L-1;DDP设4个浓度组，分别为0.5、1、2、4 μg·ml-1;取8BrcAMP的终浓度为15 μmol·L-1分别与DDP 0.5、1、2、4 μg·ml-1两药联合。分别于培养24、48、72 h后加入MTT液(5 mg·ml-1)10 μl 37 ℃ 4 h，弃上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，待结晶物完全溶解后，于酶标仪492 nm波长处，空白调零，测定各孔吸光度(A)值，以A值为纵坐标，以时间为横坐标，绘制生长曲线。上述每种浓度复种3孔。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率(IR)。IR=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。联合用药对细胞增殖抑制率的计算用q值表示,q=R(A+B)[RA+(1-RA)/RB]。R(A+B)为两药A、B合用时对细胞的抑制率，RA为A药对细胞的抑制率，RB为B药对细胞的抑制率。若q值在0.85～1.15范围内表示两药作用相加，q值>1.15表明两药作用协同，q值<0.85则表示两药合用有拮抗作用。

　　1.2.3 RTPCR技术检测EGFR mRNA表达水平 A549细胞经RPMI1640培养液(空白组)、DDP 2 μg·ml-1(DDP组)、8BrcAMP 20 μmol·L-1(cAMP组)、DDP 2 μg·ml-1联合8BrcAMP 20 μol·L-1(联合组)体外孵育48 h后，用Trizol试剂一步法提取细胞总RNA，按RTPCR试剂盒说明，在反应系统中加入总RNA 2 μg，42 ℃反应30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，1个循环。将mRNA逆转录成cDNA。以EGFR基因特异性引物进行PCR扩增，βactin为内参照。EGFR基因的引物序列为上游：5′CTTCTTGCAGCGATA CAGCTC3′，下游：5′ATGCTCCAATAAATTCACTGC3′，扩增片断为440 bp;反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃延伸7 min。βactin引物序列为上游：5′TTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTC3′，下游：5′GTCGGATTGATGAAACCCAGACACA3′，扩增片断168 bp;反应条件为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃延伸7 min终止反应。3%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,凝胶图像分析系统对RTPCR产物电泳条带进行密度分析。

　　1.2.4 Western blot技术检测EGFR蛋白表达水平 A549细胞经RPMI1640培养液(空白组)、DDP 2 μg·ml-1(DDP组)、8BrcAMP 20 μmol·L-1(cAMP组)、DDP 2 μg·ml-1联合8BrcAMP 20 μmol·L-1(联合组)孵育48 h后，加入含蛋白酶抑制剂complete mini的PBS缓冲液,4 ℃匀浆后10 000 g离心15 min,上清蛋白定量后,取50 μg蛋白,变性,行聚丙酰胺凝胶电泳,转移至硝酸纤维膜,6%脱脂奶粉室温封闭1 h,4 ℃过夜,洗涤后膜和鼠抗人EGFR抗体(1∶500)作用，4 ℃过夜,洗涤后加入辣根过氧化酶结合的抗鼠IgG(1∶4 000),化学发光试剂检测,X线片显影。定量分析采用分子生物学图像分析系统测定各条目的带积分灰度值,所测结果为扣除背景的积分光密度(OD值)。

　　1.2.5 流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期A549细胞，制成单细胞悬液，细胞计数，50万个·孔-1接种于6孔板中，置37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。培养24 h后，分别加入RPMI1640培养液(空白组)、DDP 2 μg·ml-1(DDP组)、8BrcAMP 20 μmol·L-1(cAMP组)、DDP 2 μg·ml-1联合8BrcAMP 20 μmol·L-1(联合组)，置培养箱内继续培养48 h。用0.25%胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，取(1～2)×106细胞置入EP管中，1 000 r·min-1离心5 min，弃去培养液,用PBS洗1次，离心弃去PBS，加入20 μl PBS制成单细胞悬液，吸取细胞悬液迅速吹入70%预冷的乙醇中振荡混匀，4 ℃冰箱固定过夜。离心弃去固定液，用1 ml PBS重悬，离心，弃去上清，加入10 μl RNA酶，微量移液器吹散细胞，置37 ℃水浴30 min。加入40 μl碘化丙啶(PI)染液，4 ℃冰箱避光染色30 min后上机检测。

　　1.3 统计学处理

　　计量资料均以x-±s表示，计数资料采用百分比(%)表示，计量资料的比较采用单因素方差分析，计数资料的比较采用χ2检验。采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 8BrcAMP联合DDP对人肺腺癌A549细胞增殖的影响 DDP对人肺癌A549细胞的增殖有显著抑制作用，随着浓度的增加及作用时间的延长，其抑瘤作用增强(P<0.05，表1)。8BrcAMP对人肺癌A549细胞的增殖有显著抑制作用,同一时间不同浓度之间及同一浓度不同的作用时间其抑制率相比有显著性差异(P<0.05，表2)。DDP联合8BrcAMP组细胞抑制率显著高于相应浓度单药组(P<0.05)。按照两药合用细胞抑制率计算公式推算,DDP与8BrcAMP联合q值在0.85～1.14之间,两者之间呈相加关系(表3)。表1 不同浓度、不同作用时间DDP对人肺腺癌A549细胞增殖的抑制率与相同培养时间、不同浓度DDP比较,a P<0.05;与同一浓度DDP、不同培养时间比较，b P<0.05表2 不同浓度、不同作用时间8BrcAMP对人肺腺癌A549细胞增殖的抑制率

　　与相同培养时间、不同浓度8BrcAMP比较，a P<0.05;与同一浓度8BrcAMP、不同培养时间比较，b P<0.05

　　2.2 8BrcAMP联合DDP对人肺腺癌A549细胞EGFR mRNA表达水平的影响 以2 μg·ml-1DDP和20 μmol·L-1 8BrcAMP干预A549细胞，作用48 h后EGFR mRNA表达情况见图1。以βactin灰度值参照，经过图像处理分析得出目的基因表达的半定量结果。8BrcAMP组、8BrcAMP加DDP组与空白对照相比较，EGFR mRNA水平表达明显减少(P<0.05)，而DDP组与空白对照组EGFR基因表达量比较差异无统计学意义，见图2。表3 8BrcAMP与DDP联用对人肺癌A549细胞增殖的抑制效应

　　2.3 8BrcAMP联合DDP对人肺腺癌A549细胞EGFR蛋白表达水平的影响 Western blot实验结果显示，以2 μg·ml-1 DDP和20 μmol·L-1 8BrcAMP干预A549细胞，作用48 h后，8BrcAMP组、8BrcAMP加DDP组EGFR蛋白表达显著减少，与空白对组比较差异有统计学意义(P<0.05)，DDP组与空白对照组相比,EGFR蛋白表达无统计学差异，见图2、3。1. 空白组; 2. DDP组; 3. cAMP组; 4. 联合组

　　图3 8BrcAMP联合DDP对人肺腺癌A549细胞EGFR蛋白表达水平的影响

　　Fig 3 Expression of EGFR protein in A549 cells treated with 8BrcAMP and DDP2.4 8BrcAMP联合DDP对人肺腺癌A549细胞细胞周期的影响 8BrcAMP以20 μmol·L-1浓度作用于人肺癌A549细胞24 h后，与对照组相比，G1期细胞比例下降(P<0.05)，G2期比例上升(P<0.05)，出现G2/M阻滞。DDP 2 μg·ml-1浓度作用于人肺癌A549细胞24 h后，G0/G1期比例下降(P<0.05)，S期的细胞比例上升(P<0.01)。8BrcAMP和DDP联合作用于人肺癌A549细胞24 h后，G1期细胞比例下降(P<0.05)，G2期细胞比例上升(P<0.05)，出现G2/M阻滞。见表4。表4 8BrcAMP联合顺铂对人肺腺癌A549细胞细胞周期的影响

　　3 讨 论

　　PKA在生理调节过程中起着重要的作用，可介导细胞的黏附、运动、生长、分化、凋亡,参与多种酶及毒性氧产生、NO代谢、基因表达等。近年研究发现，以cAMP为第二信使传导通路的PKA在癌症的发生、发展过程中起重要作用。Ⅰ型PKA在多种癌细胞系、原发性肿瘤和增生过度的细胞中呈过度表达。有研究发现乳腺癌组织中，Ⅰ型PKA表达与肿瘤大小以及淋巴结转移有明显的相关性，并且可以反映细胞的增殖程度[1]。在肺癌组织中Ⅰ型PKA亦过表达，提示Ⅰ型PKA在肺癌的发生、发展、转移和预后中起重要作用[2]。Cheadle等[3]认为在卵巢癌细胞中Ⅰ型PKA的表达在卵巢癌的进展过程中起到核心作用。Ⅱ型PKA在正常非增生性组织和生长阻滞细胞中过度表达。在多种肿瘤细胞中，人为使Ⅱ型PKA过表达可以抑制细胞增殖，逆转异形表形[4-5]。Neary等[6]通过基因芯片技术研究发现，当PKA RⅡ过表达时，肿瘤细胞将发生分化，一系列与分化相关的基因上调，与此同时肿瘤细胞增殖转化的相关基因下调;PKA RⅠ过表达时，细胞分化程度低，与增殖相关的基因将上调，而分化相关的基因下调。James等[7]在研究中发现，肺癌敏感性基因RGS17介导的肿瘤细胞增殖亦通过cAMPPKA途径完成。Yaqub等[8]报道PKA在机体肿瘤免疫过程中起到重要的调节作用。因此，PKA成为肿瘤治疗的靶点。主要的治疗方法有反义寡核苷酸及位点选择性cAMP类似物。本研究选用的是位点选择性cAMP类似物8BrcAMP。8BrcAMP对PKAⅡ的亲和力高而对PKAⅠ的亲和力低，选择性地激活Ⅱ型PKA，抑制Ⅰ型PKA，减小细胞内PKAⅠ与PKAⅡ的比值。本实验结果显示，8BrcAMP对肺腺癌细胞A549干预后，可明显抑制肿瘤细胞的生长。

　　以DDP为主的联合化疗方案为临床上肺癌治疗的经典方案，然而由铂类引发的多药耐药使含铂类的联合方案临床有效率仅有30%～40%。宫璀璀等[9]通过对食管癌细胞Ea109的研究发现，8BrcAMP可以下调多药耐受相关蛋白(multidrug resistance associated protein, MRP)表达而提高肿瘤的化疗敏感性。本实验结果有类似发现，8BrcAMP能够明显加强DDP的细胞毒作用，增强DDP的抗肿瘤效果。

　　多项研究显示PKA参与细胞周期的调节，但目前有关PKA对细胞周期的调节机制并未完全明确。Bingzhi等[10]研究发现，PKA可以抑制M期促进因子(Mphase promoting facto， MPF)。MPF，即cyclin BCDK1复合体，是G2/M期转换的关键调节因子[11]。Pirino等[12]发现PKA介导的CDC25B磷酸化在小鼠卵母细胞G2期阻滞过程中发挥重要作用。本实验结果显示，8BrcAMP作用于A549细胞后，G2期细胞较对照组显著增加，出现G2/M期阻滞，抑制细胞增殖，进而诱导细胞凋亡。

　　EGFR是酪氨酸受体家族的成员之一，其胞内区的受体酪氨酸激酶(RTK)系统是其发挥作用的关键部位。已有众多证据表明EGFR在恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用。EGFR高表达可引起细胞增殖、侵袭和转移，促肿瘤血管生成，抑制肿瘤细胞凋亡[13]。文献报道EGFR在肺癌中的表达为53.1%～69.7%[14]。由于EGFR在肿瘤发生、发展起重要作用，成为肿瘤治疗的重要靶分子。本实验通过RTPCR及Western Blot技术证实8Brc AMP诱导A549细胞48 h后，EGFR转录水平及蛋白水平表达显著降低，表明癌细胞呈一定程度的逆转化或分化效应，但PKA与EGFR之间具体调节通路有待进一步研究。

　　总之，8BrcAMP、DDP均可抑制A549细胞增殖。8BrcAMP可显著提高DDP的细胞毒作用，提高化疗效果，并将细胞阻滞于G2/M期。另外8BrcAMP可以下调EGFR表达，可一定程度地逆转化癌细胞。

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