细胞因子在慢性病毒性心肌炎心肌纤维作用及清心Ⅱ号的干预作用

作者：刘旺 窦丽萍 徐百鸿 王娟 程志清   

作者单位：浙江中医药大学 杭州 310053

【摘要】  ［目的］探讨TGFβ1在反复病毒感染致慢性病毒性心肌炎心肌纤维化对纤维连接蛋白及其受体整合素β1表达的影响与清心Ⅱ号干预作用。［方法］建立病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化模型后小鼠随机分为模型组、卡托普利治疗组、清心Ⅱ号高、中、低治疗组,正常组和模型组给予生理盐水灌胃,治疗组分别给予卡托普利和清心Ⅱ号高中低剂量灌胃。疗程结束后分别采集心脏,应用RT-PCR技术检测CVB3-RNA；免疫组化技术检测TGFβ1和FN;免疫荧光染色-共激焦扫描分析整合素β1。［结果］造模后TGFβ1、整合素β1、FN明显增高，应用RT-PCR在心肌中可检测出病毒，清心Ⅱ号干预后TGFβ1、整合素β1、FN减低，各治疗组病毒减少。［结论］病毒、TGFβ1、整合素β1及FN在心肌纤维化形成中具有重要作用，清心Ⅱ号具有抗病毒、抗心肌纤维化作用。

【关键词】  整合素β1；清心Ⅱ号；心肌炎；心肌纤维；TGFβ1;纤维连接蛋白;免疫组化；激光共聚焦

　　基金项目：浙江省自然科学基金资助计划项目（No:Y207808）    　　Fund project:Item supported by Zhejiang Provincial Natural Scientific Foundation（No:Y207808）　　The Effect of Cytokine on Myocardial Fibrosis of Chronic Viral Myocarditis and the Interventional Treatment of QingXinⅡ

　　Liu Wang，Dou Liping，Xu Baihong，et al

　　Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou(310053)

　　Abstract:［Objective］To study the effect of TGFβ1 on the expression of fibronectin and β1 integrin receptor in chronic viral myocarditis of myocardial fibrosis induced by repeated virus infection and the interventional effect of QingXin.［Methods］ Establish mice model of myocardial fibrosis in chronic stage of viralmyocarditis,then divide the mice model into model group，captopril group，QingXinⅡ high dose,medium dose and low dose groups.The normal group and model group are given saline through stomach perfusing，as well as the treated group are given respectively captopril and QingXinⅡ high,medium and low dose in the same way.After the treatment，hearts are collected，CVB3- RNA are detected by RT-PCR，TGFβ1 and FN are detected by immunohistochemical technique，integrinβ1 are analyzed by immunofluorescence staining-confocal laser scanning.［Results］ After having done the model，TGFβ1,integrinβ1,FN has increased obviously；virus can be detected in themyocardium by RT-PCR；after the intervention of QingXinⅡ，TGFβ1,integrinβ1,FN has decreased，virus has reduced in treated group.［Conclusion］ Virus，TGFβ1，integrinβ1 and FN have important effects on the formation ofmyocardial fibrosis；QingXinⅡ has the function of antivirus and anti-myocardial fibrosis.

　　Key words:integrin β1；QingXin Ⅱ;myocarditis;myocardial fibrosis;TGFβ1;fibronectin；immuno-hischemical technique；confocal laser scanning

    病毒性心肌炎慢性期的主要病理特征为心脏间质纤维化,临床病理表现为心脏顺应性下降,僵硬度增加,进而引起舒张功能障碍,可发展为DCM,同时也是顽固性心律失常、慢性心功能不全难以逆转、猝死的重要原因之一。由于病毒的持续存在，心肌不断损伤，最终导致心肌纤维化，但具体机制欠清，本实验从细胞因子角度阐述纤维化形成机理并进一步阐明清心Ⅱ号抗心肌纤维化的机制。

 1  材料及方法

　　1.1  实验动物

　　健康雄性Balb/c小鼠，体重14～16g，购自中科院上海实验动物中心，浙江中医药大学动物实验中心饲养，动物质量合格证号:SCXK(沪)2003-0003，饲养于清洁动物房内，动物饲养设施条件合格证：SYXK(浙)2003-0003。

　　1.2  实验病毒及药物

　　柯萨奇B3病毒(CVB3)(Nancy株,TCID50=10-7),由复旦大学附属中山医院病毒性心肌病重点实验室提供,本实验室-70℃低温冰箱保存。清心Ⅱ号(人参、丹参、苦参组成),水煎醇提，喷雾干燥，浙江中医药大学药学院制剂室提供。

　　1.3  试剂

　　免疫组化检测试剂盒EnVisionTM Two-Step Histostaining Reagent Lot:00002568101，丹麦DAKO公司产品；TGF-β1为Rabbit来源的多克隆抗体Lot:8923100，工作浓度均1：50，武汉博士德生物公司产品；Fibronectin为Mouse来源单克隆抗体，Labvision NeoMarkers公司产品；整合素β1为美国BD公司的产品，Rabbit来源的多克隆抗体，工作浓度均1：75）；引物：上海Sangon生物工程技术公司合成，序列如下：coxsackie,上游TAACACACACCGATCAACAG,下游ATGGCCAATCCAATAACTAT,扩增产物大小为522bp;GAPDH,上游GAGGCCGGTGCTGAGTATGT,下游CTTCTGGGTGGCAGTGATGG,扩增产物大小为294bp；PCR试剂购于大连宝生物工程有限公司。

　　2  方法

　　2.1  动物模型的制备及分组

　　健康、雄性Balb/c小鼠200只，习惯性饲养2d后，参照文献［1-2］成功造模方法及预试验结果，随机分出正常对照组10只，腹腔接种不含病毒的Eagle，s液，接种日期及次数同以下各组，其余首次腹腔接种内含CVB3TCID50=10-5的1：2000病毒稀释液0.2ml／只后常规饲养，14天腹腔接种1：1600浓度CVB3病毒液0.2rnl／只，28天后腹腔注射1：800浓度CVB3病毒液0.2rnl／只，60天后成活小鼠为病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化模型。随机选取78只，并随机分为5组：模型组10只、卡托普利组和清心Ⅱ号高剂量组、中剂量组、低剂量组分别为17只。造模2个月后，清心Ⅱ号治疗组分别按高、中、低剂量灌胃，卡托普利治疗组按45mg/kg灌胃，模型对照组、正常对照组给予等量生理盐水灌胃，每日1次,疗程为45d。

　　2.3  观察指标及检测方法

　　2.3.1  动物的一般情况（精神状态、活动度、皮毛光泽度、皮温及死亡情况）。

　　2.3.2  心脏组织病理学观察：疗程结束后，小鼠活杀断头取心脏，右心室和室间隔部，置于液氮中，用作RT-PCR实验的CVB3  基因检测；剩余部分心肌立即放在10%中性缓冲福尔马林（pH7.4）固定液中固定，石蜡包埋后常规连续切片，厚4μm，60～62℃烘箱烤片后，做HE染色和VG特殊染色及免疫组化染色。

　　2.3.3  TGF-β1、Fibronectin免疫组织化学的检测：石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，3%双氧水阻断内源性过氧化物酶10min，PBS洗，滴加一抗、二抗；37℃孵育40min;DAB显色（Fibronectin为AEC显色，阳性呈红色）,封片。以PBS代替一抗作空白对照。利用HPIAS-1000病理图文分析系统半定量分析TGFβ1、Fibronectin蛋白水平的表达，即对每张切片的心肌阳性细胞的着色强度采用HPIAS-1000病理图文分析系统进行测量。每张切片随机采集5个视野（×200倍），经过该系统自动分析分别获得该5个视野的5个平均值（分别为：平均光密度值、积分光密度值），经平均后代表该标本的染色强度，代表该蛋白的表达强度。

　　2.3.4  整合素β1免疫荧光染色-共激焦扫描：石蜡切片二甲苯脱蜡、乙醇梯度水化。抗原修复，滴加适当比例稀释的整合素β1一抗，37oC孵育1h；用PBS代替一抗为空白对照。PBS冲洗，滴加山羊抗兔IgG抗体-荧光素FITC标记，0.1%DAPI液衬染；20%甘油封片剂封片；共激焦显微镜下观察扫描及照相，心肌细胞胞浆呈黄绿色为阳性，细胞核呈蓝色。应用Leica共激焦显微镜自带的分析程序进行图像分析，以整合素β1像素值占总像素百分比作为整合素β1的像素密度，即以整合素β1像素密度代表整合素β1量的高低。

　2.3.5  CVB3RNA的RT-PCR检测:总RNA抽提及鉴定、逆转录反应后聚合酶链反应:Eppendorf管中依次加入10×Taq Buffer缓冲液5μl,上下游引物各2μl,MgCl2(25mM)4μL,Taq酶(5U/μl)0.5μl，dNTP(2.5mM)4μl，DEPC水30.5μl。95℃预变性5min,94℃变性25s,58℃退火35s,72℃延伸15s,终末延伸7min，35个循环，4℃保温。样本以基因GAPDH作为内参照，经1.5%琼脂糖凝胶（含EB）电泳，紫外光下拍照，电泳结果用Syngene成像分析系统（英国）进行扫描及灰度分析，对阳性电泳条带进行吸光度峰值下面积积分，以coxsackie和GAPDH条带吸光度积分的比值作为样本相对量。

　　2.4  统计学处理

　　数据以x±s表示,两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，均以P<0.05为有显著性差异。

　　3  结果

　　3.1  各组小鼠一般情况　

　　实验期间正常组小鼠表现机警，反应快，皮毛致密整齐，有光泽，活动正常，无死亡。其余各实验组小鼠精神不振，反应迟钝，皮毛无光泽，活动减少，肛门坠粪，治疗组小鼠上述情况有所好转，除正常组和高剂量组外各组小鼠有不同程度死亡，其中模型组死亡1只，卡托普利组死亡2只，中剂量组死亡2只，低剂量组死亡5只。

　　3.2  心肌HE染色和VG染色结果

　　心肌HE染色在正常组心肌细胞排列整齐，模型组可见少量炎性细胞浸润，心肌细胞间可见明显纤维化和钙化，治疗组随剂量增加，炎细胞浸润减少，纤维化和钙化有所减轻。在VG染色下，心肌细胞呈黄色，胶原纤维呈红色，正常情况下胶原纤维含量少，主要分布于血管周围，而模型组胶原纤维明显增加在心肌细胞间胶原明显增生，心肌细胞排列欠整齐，治疗组心肌细胞纤维化随剂量增加，纤维化渐减轻（如图1～4）。

　　3.3  心肌整合素β1,FN,TGFβ1表达  见表1。表1  各组心肌TGFβ1，FN蛋白表达情况（略）

    造模后模型组与正常组比较，FN、TGFΚ1明显增高。经治疗后，各组TGFΚ1及清心Ⅱ号高中剂量组、卡托普利组FN均明显减低，但FN低剂量组减低不明显（与模型组比较P>0.05）。TGFΚ1在清心Ⅱ号高中剂量组接近于正常组，低剂量组、卡托普利组与正常组有差距（P>0.05）。FN在各组与正常组有差距。清心Ⅱ号各治疗组与卡托普利组比较无差异，清心Ⅱ号各治疗组之间亦无差异。表2  各组心肌整合素β1表达情况（略）　　　造模后模型组与正常组比较，整合素β1明显增高。经治疗后，各组整合素β1均明显减低（与模型组比较P<0.05），但尚未接近于正常组。清心Ⅱ号各治疗组与卡托普利组比较无差异，清心Ⅱ号各治疗组之间亦无差异（如图13-16）。

　　3.4  各组小鼠心肌内CVB3RNA表达水平情况

　　正常组未检测到CVB3。治疗后，清心Ⅱ号高、中剂量组、卡托普利组CVB3明显减少，低剂量组减少不明显（P>0.05）；高、中剂量组与卡托普利组无明显差异（P>0.05），卡托普利组比低剂量组CVB3减少显著；清心Ⅱ号高、中剂量之间无差异（P>0.05），低剂量抑制病毒作用差。见表3、图5。表3  各组小鼠心肌内CVB3RNA表达（略）

　　4  讨论

    自从Petiyean J等［3］利用RT-PCR在患者心肌活检标本中也发现了肠道病毒RNA，慢性病毒性心肌炎病毒持续感染已成共识，病毒之所以能长期存在于心肌，可能是由于病毒RNA变异，不能合成衣壳蛋白，对复制方式为一种限制型或替代型，但病毒RNA仍可产生具有抗原特异性的非感染性缺陷型病毒颗粒，导致进展性的心肌损伤，包括病毒对心肌的直接损伤和免疫反应引起的心肌损伤［4-6］。损伤的心肌细胞及浸润的炎细胞释放TGFβ1并被活化，对成纤维细胞有强烈的趋化作用，同时诱导浸润细胞及常居细胞产生更多的TGFβ1，这种自我诱生放大的TGFβ1促使成纤维细胞分泌大量的细胞外基质。成纤维细胞在TGFβ1的作用下，先合成大量的纤维连接蛋白，随后Ⅰ、Ⅲ型胶原表达增多［7］。

 研究发现,心肌炎早期即有大量FN沉积,随着病程进展FN持续增加并伴以大量胶原沉积,参与调节细胞的生长、分化、黏附及运动等生物活动［8］。而FN的这些作用是通过其受体整合素介导的。

    整合素是由α和β两条肽链组成的二聚体，目前已知α亚基有16种，β亚基有8种。不同的整合素具有结合一种或多种细胞外基质的能力。如α1β1，α2β1，α3β1能与层成粘连蛋白结合，而α3β1和α4β1整合素能与纤维粘连蛋白结合。

    在整合素家族中，整合素β1独特表达于心肌，它的主要功能是作为心肌细胞与细胞外基质(ECM)相互作用的黏附受体,使细胞得以附着ECM形成整体，介导细胞察觉环境变化并做出反应或改变环境的能力。纤维连接蛋白分子通过整合素受体将心脏间质细胞-胶原纤维-心肌细胞相互联结为一个整体。因此，抑制纤维连接蛋白和整合素的合成，即可对心肌纤维化的治疗达到事半功倍的作用。实验中，模型组整合素β1比正常组增高，出现心肌纤维化，经治疗后纤维化减轻，整合素减低。而纤维连接蛋白亦由增高到减低，与整合素同步增减。而抑制心肌中病毒，也同时达到了抑制TGFβ1合成的目的。由实验可知，心肌中病毒与心肌中TGFβ1与FN及其受体整合素β1成相关效应，因此，抑制心肌中病毒是治疗心肌纤维化的关键。

    清心Ⅱ号（由人参、丹参、苦参组成）是长期应用于心肌炎临床治疗的行之有效的方剂，方中人参具有益心气养心阴作用，苦参能清热解毒，丹参活血化瘀。现代药理学研究证实：人参、苦参、丹参均具有清除氧自由基作用，人参、苦参对柯萨奇B组病毒等均有抑制和杀灭作用。丹参可促进SOD的产生，具抗氧化、抗自由基的作用，从而能保护心内皮细胞以及心肌细胞,预防氧自由基导致的心肌细胞变性、坏死及成纤维细胞增殖［9］。该方充分体现了中药复方的多靶点、多效应的作用，既抗病毒达到抗炎的目的，又能抑制TGFβ1与FN及其受体整合素β1，尚能克复卡托普利的副作用，达到良好的抗心肌纤维化的目的。

【参考文献】  　　［1］王振涛，韩丽华，朱明军，等.心肌康对慢性病毒性心肌炎小鼠心肌CVB3病毒RNA表达影响的研究［J］.中华实用中西医杂志，2003，3(16)：1721-1723.

　　［2］程志清,刘宏飞,张娟，等.病毒性心肌炎慢性期Th细胞凋亡蛋白的表达以及清心Ⅱ号的干预作用［J］.中华中医药学刊，2007，25（6）：1098-1100.

　　［3］Petitjean J，Kopecka H，Freymuth F，et al.Detection of enteroviruses in endomyocardial biopsy bymolecular approach［J］.Jmed Virol,1992,37(1):76-82.

　　［4］Baboonian C,DaviesmJ,Booth J,et al.Coxsackie B viruses and heart disease［J］.Curr Topmicrobiol Immunol，1997,223：31-32.

　　［5］Batra AS,Lewis AB.Acutemyacarditis［J］.Curr Opin Pediair,2001,13(3):234-9.

　　［6］叶春华，程志清.心肌纤维化与病毒性心肌炎［J］.浙江中医学院学报，2004，28（4）：85-87.

　　［7］Zhang K,Garner W,Cohen L,et al.Increased type I and iii collagen and transforming growth factorβ1mrna and protein in hyprtrophic burn scar［J］.Jnvest Denatol，1995，104(5):750.

　　［8］Linares HA.From wound to scar［J］.Burns，1996，22:3392352.

　　［9］唐忠志，郑智，唐瑛，等.丹参对自发性高血压大鼠心肌纤维化的逆转作用及其机制研究［J］.华中科技大学学报(医学版)，2002，31（3）:292-351.