中性粒细胞凋亡与体外循环全身炎性反应相关性研究

作者：赵志勇,阎志军,赵砚丽

作者单位：河北省人民医院心脏外科，河北 石家庄 050051

     【摘要】  目的 探讨中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)凋亡与体外循环(extracorporeal circulation,ECC)全身炎性反应的相关性及意义。 方法 50例ECC心脏直视手术病人，于ECC前、ECC结束时、ECC结束后4h、术后第1d晨四个时点采取静脉血，以全血细胞计数仪测定PMN数量，流式细胞仪测定PMN凋亡率和PMN表面粘附分子CD11b表达变化，ELISA法测定血浆弹性蛋白酶浓度，透射电镜观察PMN凋亡细胞形态学变化。 结果 PMN凋亡率在ECC期间明显降低，与ECC时间呈负相关。PMN数量、CD11b表达、血浆弹性蛋白酶浓度在ECC期间明显升高，与其凋亡率呈负相关，且血浆弹性蛋白酶浓度与ECC时间呈正相关。透射电镜下可见典型的PMN凋亡细胞。 结论 ECC导致PMN的凋亡受抑数量增加、生存周期延长、CD11b表达上调、脱颗粒释放弹性蛋白酶增加，加剧炎性反应扩散和组织损伤，炎性反应进一步迁延。

【关键词】  中性粒细胞；细胞凋亡；体外循环；炎性反应；CD11b；弹性蛋白酶

    Correlation between Polymorphonuclear Neutrophil Apoptosis and

    Systemic Inflammatory Response to Extracorporeal Circulation

    ZHAO Zhi-yong，YAN Zhi-jun，ZHAO Yan-li，LI Jian-li，FENG Guang-xing，

    HE Rong-hai，GAO Yong-qian，YU Xin-jiang

    (Department of Cardiovascular Surgery,HeBei Provincial Peoples Hospital,

    Hebei Shijiazhuang 050051,China)

    Abstract: OBJECTIVE   To investigate the correlation and significance between polymorphonuclear neutrophil (PMN) apoptosis and systemic inflammatory response to extracorporeal circulation (ECC).　METHODS  Fifty patients undergoing open heart surgery with ECC were studied. Blood samples were drawn from the central venous line before starting ECC, at the end of the ECC, 4 hours after ECC and on the frist postoperative morning. The PMN counts were performed by blood cell counter. PMN were isolated, and its apoptosis and the expression of CD11b were evaluated by flow cytometry. The plasma concentration of elastase was determined by enzyme-linked immunosorbentassays. The morphological change of PMN apoptosis was detected by transmission electron microscope.　RESULTS  The rates of PMN apoptosis were significantly reduced during ECC until the frist postoperative morning, and the rate at 4 hours after ECC negatively correlated with the duration of ECC. The PMN counts,the expression of PMN CD11b and the levels of plasma elastase were markly increased during ECC, and at 4 hours after ECC inversely correlated with PMN apoptosis rate. Peak elastase levels correlated positively with the duration of ECC. PMN apoptosis was showed under electron microscope.　CONCLUSION  ECC suppress PMN apoptosis,increase PMN count,and prolong the functional lifespan of PMN. The inhibition of PMN apoptosis cause upregulation of PMN CD11b expression and elevation of plasma PMN elastase level,potentiate and prolong the systemic inflammation response induced by ECC.

    Key words：  Polymorphonuclear neutrophil；Apoptosis；Extracorporeal circulation；Systemic inflammation response；CD11b；Elastase

  内直视手术中重要的辅助手段。ECC可触发全身炎性反应［1］ 。中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil, PMN）是炎性反应的重要标志，在炎性反应的发生、发展和转归中起着至关重要的作用。ECC导致体内环境发生巨大变化，将对中性粒细胞凋亡及其机能产生如何影响，目前国内尚未见报道。因此，我们选择了在我科行ECC心内直视手术的50例病人，观察其在ECC前后PMN凋亡率、数量、CD11b、血浆弹性蛋白酶水平的变化及其与PMN凋亡之间的关系，从而探究PMN凋亡和ECC全身炎性反应之间的相关性。

    1  资料与方法

    1.1  病例选择  本组中男34例，女16例。年龄1.42～60（20.5±20.75）岁。体重10～71（34.3±20.24）kg。其中行主动脉瓣和二尖瓣双瓣置换术11例，室间隔缺损修补术11例，房间隔缺损修补术9例，冠状动脉旁路移植术6例，法洛四联症根治术5例，二尖瓣置换术4例，主动脉瓣置换术4例。无系统性疾病，近1月内未应用过抗生素及对白细胞有细胞毒性的药物（如非甾体类药物）或免疫抑制剂。

    1.2  麻醉及ECC方法  全部病例均于术前30min肌注度冷丁1 mg/kg，东莨菪碱0.01 mg/kg，麻醉诱导为芬太尼5 μg/kg，咪唑安定0.15 mg/kg，万可松1.5 mg/kg，气管插管全身麻醉，麻醉维持应用芬太尼25～30 μg/kg，间断应用万可松、异丙酚或恩氟烷吸入麻醉。ECC均采用Sarns-7400人工心肺机，西京-90鼓泡式氧合器和科威-87微栓滤器。血定安、林格氏液等预充，晶胶比1∶0.6～0.8。转机前常规肝素化抗凝（3 mg/kg），ECC中追加肝素抗凝，保持ACT>480s。动脉流量80～120ml/（kg·min），术中维持血压40～60 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。血液中度稀释，浅中度降温。St.Thomas液间断灌注心脏。停机后按1∶1用量以鱼精蛋白中和体内肝素。术中不用激素、抑肽酶及全血，以免影响结果。ECC时间为39.78～200.07（90.79±51.27）min。

    1.3  标本采集与处理  分别于ECC前（T1），ECC结束时（T2），ECC结束后4h（T3），术后第1d晨（T4）共4个时点取外周静脉血标本4 ml，加肝素抗凝（血:肝素=9∶1），肝素化血不抗凝，1 h内进行标本处理。

    用20PR-52D型低温高速离心机（日本HITACHI公司）于4℃，2000转/min离心10 min，取血浆置于-80℃保存待测。取白细胞层和部分血浆与等量PBS液混合，置于2ml淋巴细胞分离液（北京华美公司）面上。4℃，2000转/ min离心20 min，弃上清及淋巴细胞层，沉淀物即为PMN。若混有较多的红细胞可用低渗蒸馏水去除红细胞。

    PBS液（0.01M，pH 7.4）将PMN制成1×106/ml细胞悬液待测，经涂片瑞氏染色分类，PMN纯度>98% ，涂片台盼蓝染色活细胞>95% 。

    1.4  指标检测

    1.4.1  PMN数量测定  取外周全血0.1ml用Sysmex F-820型全血细胞计数仪（日本TOA公司）测得PMN数量和红细胞压积（Hct）。由于ECC期间血液稀释因素，PMN数量由Hct值按如下公式进行校正：

    PMN校正值=PMN测得值×（ECC前Hct值／Hct测得值）   

    　 1.4.2  PMN凋亡率检测  取1×106/ml PMN悬液1ml，加入20 μl RNaseA酶，37℃水浴30 min，加入含0.1%Triton-X 100的碘化丙啶（PI）染液（美国Sigma公司）0.5ml混匀，至4℃避光静置30 min，用FACS Vantage 流式细胞仪（美国Beckton-Dickinson公司），光源为488nm的氩离子激光，上机前先以标准微球调整仪器的变异系数<2%。用CELL QUEST软件进行分析，共检测10000个细胞，计算阳性细胞百分数，即凋亡率（AP%）。

   1.4.3  PMN CD11b测定  取1×106/ml PMN悬液1ml ，加入20 μl PE标记的鼠抗人CD11b单克隆抗体（美国PharMingen公司），室温避光静置15 min，1500转/ min离心5 min，弃上清，加PBS（含0.1% 叠氮钠）2ml振荡混匀，1500转/ min离心5 min，弃上清，加1%多聚甲醛0.5ml固定。用FACS Vantage流式细胞仪CELL QUEST软件进行分析，共检测10000个细胞，计算阳性细胞平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity，MFI）。

    1.4.4  血浆弹性蛋白酶测定  将-80℃保存的样本血浆取出，平衡至室温。按照人血浆PMN弹性蛋白酶检测试剂盒（ELISA法，奥地利Bender MedSystems公司）说明书进行检测，分光光度计测450nm OD值，以标准品PMN-Elastase浓度为横坐标，不同稀释浓度OD值为纵坐标绘制标准曲线。用样品OD值在标准曲线上查找相应的PMN-Elastase浓度值，将测得浓度值乘以稀释倍数（×100），即得出实际PMN-Elastase浓度值。

    1.4.5  透射电镜形态学观察  取1×106/ml PMN悬液 5 ml，1000转/ min离心10 min，弃上清 ，4%戊二醛2 ml固定2 h，用0.1M PB缓冲液冲洗1次，1%锇酸后固定30～60 min，常规电镜样品制备程序脱水、渗透、包埋、超薄切片，铀铅染色，在透射电镜下观察凋亡细胞形态学变化，照相并记录实验结果。

    1.5  统计学处理  应用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。所有数据均以均数±标准差(±s )表示，采用自身对照，自身配对t检验或t' 检验和相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  PMN凋亡率  PMN凋亡率于ECC结束时、ECC结束后4 h均较ECC前明显降低（P<0.05、P<0.01），于术后第1 d晨恢复ECC前水平。凋亡率与ECC时间呈负相关（r=-0.4521，P<0.05），见表1、图1。

    2.2  PMN数量  PMN数量在ECC期间明显升高，并持续升高至术后第1 d晨（与ECC前相比P<0.01）。ECC结束后4 h 其数量与其凋亡率呈负相关（r=-0.4528，P<0.05），见表1。

    2.3  PMN CD11b表达  PMN CD11b表达在ECC结束时、ECC结束后4 h均较ECC前明显增高（P<0.05、P<0.01），于术后第1 d晨恢复ECC前水平。CD11b峰值水平与凋亡率呈负相关（r=-0.6415，P<0.01），见表1。

    2.4  血浆弹性蛋白酶水平  血浆弹性蛋白酶水平在ECC结束时、ECC结束后4 h均显著升高(与ECC前相比P<0.01)，于术后第1d晨恢复ECC前水平。血浆弹性蛋白酶峰值水平与凋亡率呈负相关（r=-0.4625，P<0.01），并与ECC时间呈正相关（r=0.5757，P<0.01），见表1。

    2.5  PMN凋亡形态学变化  透射电镜下观察结果显示有典型的凋亡PMN出现，细胞和细胞核体积缩小，染色质固缩，聚集于核膜呈境界分明的新月形小体，细胞浆浓缩，胞浆中各种细胞器结构基本正常，见图2。

    图2  PMN凋亡形态学变化（5.0K×ZOOM）

    3  讨  论

    通常PMN在循环中存活不超过1天，通过凋亡表达而死亡。凋亡的PMN在膜完整的状态下被巨噬细胞吞噬、清除，一方面使其不释放内容物，另一方面也缩短了其介导炎性反应的时间。因此，PMN凋亡被认为是炎症消散的关键，是机体自我限制炎性反应的一种重要方式［2-3］，但PMN凋亡非常容易被环境信号所调节改变。

    实验结果显示PMN凋亡于ECC开始后明显降低，至术后第1天晨恢复术前水平。而其数量从ECC前到ECC结束后4h的变化趋势与凋亡率的变化趋势正好相反，呈负相关关系，且PMN凋亡率与ECC持续时间呈负相关，这与Chello和Sakai的实验结果相同［4-5］。说明ECC使PMN生存的循环环境发生巨大变化，导致其凋亡受到抑制，受抑严重程度与ECC持续时间呈正比。凋亡受抑使PMN不能按正常程序死亡和被及时清除，其生命功能周期延  表1  不同时点PMN数量、凋亡率、CD11b 、弹性蛋白酶的变化注：*与ECC前比较，P＜0.05；**与ECC前比较，P＜0.01 长，数量增加，释放大量具有组织毒性及酶解基质蛋白作用的内容物。同时产生如前列腺素、白三烯、血小板活化因子和活性氧等多种炎性介质，使炎性反应迁延并放大，组织损伤加重［6］。随着ECC的结束，凋亡抑制因素解除，PMN凋亡率逐渐恢复ECC前水平。

  术后第1天晨PMN凋亡率基本恢复ECC前水平，而其数目却持续增多达到高峰，可能是由于机体对全身炎性反应发生应激反应，使着边PMN动员以及骨髓释放大量未成熟PMN入血所致［7］。

    炎性反应中PMN与血管内皮细胞的粘附是其游出血管壁，释放有害物质引起组织损伤的关键步骤［8］。PMN的粘附是由其膜表面的粘附分子所介导的，其中以CD11b/CD18最为重要。本实验中显示CD11b表达峰值与PMN凋亡率呈负相关，表明ECC中由于PMN凋亡受抑制，使作为PMN活化标志物的CD11b表达亢进，促进PMN与内皮细胞粘附，游出血管壁，释放有害物质引起组织损伤。同时CD11b表达上调又可进一步抑制PMN凋亡［9］，导致ECC全身炎性反应的发生、发展和扩大。当ECC结束，PMN凋亡逐渐恢复，CD11b表达也恢复到正常水平。

    与Tang等［10］实验结果相似，血浆弹性蛋白酶水平于ECC中开始明显升高，至术后第1天晨恢复术前水平。其峰值水平与PMN凋亡率呈负相关，与ECC时间呈正相关，这说明ECC导致PMN凋亡受抑制，功能周期延长，PMN不能及时发生凋亡，使其趋化和脱颗粒功能升高，导致弹性蛋白酶等继发性炎性介质大量向细胞间质逸出，引起细胞外基质中各种成分降解，激活前明胶酶原破坏血管内皮基膜，破坏内皮细胞、上皮细胞间紧密连接，导致炎症细胞向组织浸润，造成组织损伤［11］。随着ECC后PMN凋亡的恢复，其游动扩散，脱颗粒和趋化功能降低，血浆弹性蛋白酶水平亦恢复正常。

    正常生理情况下，PMN的增殖与凋亡保持动态平衡，这既有利于机体的防御反应又有利于炎性反应的消散。当ECC时，由于多种因素的综合作用使PMN凋亡受到抑制，细胞活化，进而使CD11b表达上调和内皮细胞粘附增强，释放弹性蛋白酶等炎性介质增多，加剧炎性反应扩散和组织损害，导致ECC全身炎性反应进一步迁延。随着ECC结束，PMN凋亡恢复正常，炎性反应得以控制。

    由于凋亡是PMN介导炎性反应终止的重要生物步骤。因此，对ECC中PMN凋亡机制及其机能的变化情况作进一步深入研究，将为我们监控和调节体外循环全身炎性反应，预防和治疗应激性损伤开辟一条崭新的途径。

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