体外循环对小儿中性粒细胞凋亡及其调控蛋白的影响

作者：赵砚丽,李建立,武懿作者单位：河北省人民医院,1.麻醉科;2.心外科,河北 石家庄 050051

  【摘要】  目的 动态观察患儿在体外循环（extracorporeal circulation,ECC）各时段外周血中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil,PMN）的凋亡率，及其脂肪酸合成酶(Fas)、B细胞淋巴瘤(Bcl-2)蛋白表达的变化规律，为临床从PMN凋亡调控入手防治ECC引发的全身炎性反应（SIRS）提供实验室依据。方法 选择择期ECC下行室间隔缺损修补术的患儿30例，采用流式细胞术检测ECC前（T0），ECC开始后30 min（T1），停ECC后30min（T2），术后24 h（T3）各时点静脉血中PMN的凋亡率、Fas和Bcl-2的表达。结果 与T0比较，PMN凋亡率在T2达最低值（P＜0.05），与ECC持续时间呈负相关（r=-0.648，P＜0.05）；与T0比较，PMN膜上Fas阳性表达百分数在T2时点降低（P＜0.05），与PMN凋亡率呈正相关（r=0.546，P＜0.05）；与T0比较，T1、T2、T3时点PMN胞内Bcl-2阳性表达百分数升高（P＜0.05），与PMN凋亡率呈负相关（r=-0.569，P＜0.05）。结论 小儿ECC触发全身炎性反应的过程中产生的多种凋亡抑制因素使PMN凋亡受到抑制，其机制与PMN的Fas表达下调和Bcl-2表达上调有关。

【关键词】  体外循环；中性粒细胞；细胞凋亡；脂肪酸合成酶;B细胞淋巴瘤

    Effects of Extracorporeal Circulation on Polymorphonuclear Neutrophil

    Apoptosis and Related Protein in Pediatric

    ZHAO Yan-li，LI Jian-li，WU Yi,LIU Xiao-ming,DU Yan-ru,YAN Zhi-jun

    (Department of Anesthesiology,HeBei Provincial Peoples Hospital,Hebei ShiJiaZhuang 050051,China)

    Abstract: OBJECTIVE   To investigate the changes in polymorphonuclear neutrophil（PMN） apoptosis and Fas, Bcl-2 protein expression of pediatric patients  undergoing open-heart surgery with ECC, and to give the experimental basis for treating systemic inflammatory reaction syndrome(SIRS). METHODS  Thirty pediatric patients with ventricular septal defect undergoing open-heart surgery with ECC were studied. Blood samples were taken after induction of anesthesia(T0),30 minutes after the initiation ECC(T1),30 minutes after the termination ECC(T2) and 24 hours post-operatively(T3). PMN apoptosis and the expression of PMN Fas, Bcl-2 protein were detected by flow cytometry. RESULTS  Compared with T0, the rate of PMN apoptosis reached to its lowest value at T2(P<0.05). The percentage of PMN apoptosis correlated negatively with the duration of ECC (r=-0.648，P<0.05). Fas on PMN membrane at T2  was significantly downregulated than T0. Fas levels correlated positively with PMN apoptosis rate (r=0.546,P<0.05). PMN intracellular expression of Bcl-2 at T1,T2,T3 was significantly upregulated than T0 (P<0.05). Bcl-2 levels correlated negatively with PMN apoptosis rate(r=-0.569,P<0.05). CONCLUSION  The PMN apoptosis can be delayed by ECC. The inhibition of PMN apoptosis has relation with the down regulation expression of Fas and the upregulation expression of Bcl-2.

    Key words：  Extracorporeal circulation;Polymorphonuclear neutrophil;Apoptosis;Fatty acid synthetase;B cell lymphoma-2

 体外循环（extracorporeal circulation,ECC）诱发机体全身炎性反应（SIRS）过程中，中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil,PMN）大量激活、渗出并沉积于组织，造成周围组织损伤。凋亡是PMN从炎症部位非炎性清除的有效方式。本研究通过动态观察室间隔缺损患儿ECC围手术期PMN凋亡率的变化、细胞膜上脂肪酸合成酶(Fas)与细胞内B细胞淋巴瘤(Bcl-2)蛋白表达的变化，探讨ECC延迟PMN凋亡的机制，为今后从PMN凋亡调控入手防治ECC引发SIRS提供实验室依据。

    1  资料与方法

    1.1  临床资料  择期在ECC下行室间隔缺损（VSD）修补术的患儿30例（男13，女17），年龄1～5（3.25±1.50）岁，体重10～20（14±4）kg，术前NYHA心功能分级均在Ⅰ～Ⅱ级，以上病例均无伴发其它系统性疾病，术前无感染、凝血及免疫功能异常，围术期无激素、抗生素或免疫调节剂的用药史。

    1.2  麻醉与ECC方法  所有患儿均于术前30 min肌注吗啡0.1mg/kg，阿托品0.02 mg/kg。芬太尼10 μg/kg、维库溴铵0.1 mg/kg行静脉全麻诱导进行气管内插管、桡动脉和中心静脉穿刺并置管，机械控制呼吸并吸入低浓度的异氟烷（0.8～1.3%）维持麻醉直至ECC开始。术中间断静脉注射芬太尼（总量25～30 μg/kg）维持麻醉，间断应用维库溴铵维持肌松。常规监测心电图、直接桡动脉血压、中心静脉压、脉搏氧饱和度、红细胞压积(Hct)、鼻咽温、直肠温、尿量、血气分析、呼气末CO2（PETCO2）、激活全血凝固时间（ACT）以及机械通气各项参数。

    ECC前经中心静脉导管给予3 mg/kg肝素，全身肝素化后根据ACT酌情追加0.5～1mg/kg，维持ACT在480 s以上。用Sarns 8000型心肺机，儿童型膜式氧合器（国产希健-Ⅰ）、儿童型体外循环管道（科威公司生产）和儿童型动脉微栓过滤器（科威公司生产）进行ECC。根据术前血常规检查结果，确定预充液的种类和容量，多采用6%羟乙基淀粉（130/0.4）、复方乳酸钠林格氏液及红细胞预充。在ECC开始后及时测定血液稀释度，使Hct维持在0.25～0.30。采用全身中度低温（鼻咽温27℃～31℃）恒流灌注，灌注压维持在50～80 mmHg，灌注流量为2.2～2.8 L/（min·m2）。心肌保护采用冷晶体停跳液间断进行主动脉根部灌注。转流中根据分析结果调节电解质。在撤离ECC前，患儿鼻咽温度升至36℃。ECC结束后，按1∶1的剂量用硫酸鱼精蛋白经中心静脉导管缓慢注射（7 min以上），以中和肝素。术中不用激素、抑肽酶、全血及超滤。

    1.3  标本采集和检测方法  分别于ECC前（T0），ECC开始后30 min（T1），停ECC后30min（T2），术后24 h（T3）共４个时间点采取静脉血标本，采用Ficoll液密度梯度离心法分离中性粒细胞，瑞氏染色检验分离的细胞纯度，台盼兰检验细胞活性。将PMN用70%酒精固定18 h后，用含0.1%Triton-X100和RNaseA酶的碘化丙啶（PI）避光染色，用流式细胞仪观察PMN凋亡率（AP%）。另外取各时点100 μl全血加入藻红蛋白（PE）标记的Fas荧光单克隆抗体，溶血素裂解红细胞的干扰，同时用鼠抗人PE标记IgG2aκ作同型阴性对照，用流式细胞仪检测阳性细胞百分数。检测Bcl-2的表达时，将分离的PMN悬于含10%胎小牛血清的1640培养液中，置于5%CO2，37℃培养箱中培养24 h，破膜后加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Bcl-2荧光单克隆抗体，同时用鼠抗人FITC标记IgG2aκ作同型阴性对照，流式细胞仪检测阳性细胞百分数。

    1.4  统计方法  应用SPSS10.0统计软件，计量资料采用均数±标准差(±s)表示。不同时点的数据进行重复测量数据的方差分析，两变量间的相互关系用直线相关分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

 2  结  果

    2.1  临床资料  患儿术后无继发感染及其它疾病、无死亡，均痊愈出院。ECC持续时间(52±17) min，阻断升主动脉时间（28±11）min。

    2.2  PMN凋亡率的变化  PMN凋亡率在ECC期间明显降低，与T0比较，在T2时点达最低值（1.79±0.57）%，差异有统计学意义（P<0.05），T3时点恢复ECC前水平（P>0.05）。见表1。PMN凋亡率最低值与ECC持续时间呈负相关（r=-0.648，P<0.05）。

    2.3  PMN膜表面Fas的表达  与T0比较，PMN膜上Fas的阳性细胞表达百分数在T2、T3时点降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与T2比较，T3时点数值开始上升，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。在T2时点，Fas的阳性细胞表达百分数与PMN凋亡率最低值呈正相关（r=0.546， P<0.05）。

    2.4  PMN胞内Bcl-2的表达  与T0比较，在T1、T2、T3时点PMN胞内Bcl-2的阳性细胞表达百分数升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。在T2时点，Bcl-2的阳性细胞表达百分数与PMN凋亡率最低值呈负相关（r=-0.569， P<0.05）。

    3  讨  论

    PMN的过度激活释放氧自由基、蛋白酶引起组织损伤，在ECC导致SIRS的发生、发展中起重要作用。最近研究证明，PMN凋亡是非炎性清除PMN的有效方式［1］。进入到炎症灶的PMN只能以两个途径被清除：细胞坏死或凋亡。坏死的PMN细胞膜破裂，而凋亡的PMN在膜的完整性被破坏之前可被巨噬细胞吞噬，有效阻止了内毒性颗粒内容物的释放，并对表1   ECC前后PMN凋亡率、Fas和Bcl-2表达的变化注：与T0比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与T2比较，△P＜0.01

    周围组织的损伤最小。因此，PMN凋亡启动的时机和程度是决定炎性反应的程度和转归的关键因素之一。

    我们的实验使用了流式细胞技术研究PMN凋亡。研究发现，ECC开始后PMN明显受到抑制，凋亡率在ECC中和停ECC后30min均较ECC前有明显降低，并于停ECC后30min达最低，术后24h恢复ECC前水平。这与Sakai［2］的观察结果基本一致。随着ECC的结束，炎症级联瀑布的诱发因素解除，抑制凋亡的因素也随之解除，PMN凋亡也逐渐恢复ECC前水平。而且，PMN凋亡率与ECC持续时间呈负相关，说明ECC是PMN发生凋亡延迟的因素。但是值得注意的是凋亡延迟可能不是ECC独自造成的，Chello M［3］的研究显示非ECC下冠脉搭桥手术的患者PMN也有凋亡的延迟。因此，我们研究的小儿ECC下VSD修补术后中性粒细胞凋亡延迟可能也是ECC和手术两方面所导致的。

    ECC导致的内环境的改变是一个多系统、多环节、多通路调节的复杂过程， ECC延迟PMN凋亡的具体机制目前尚不完全清楚。PMN可在多种外界因素的作用下发生凋亡的延迟或加速，此过程是一个受自身多基因调控、众多细胞因子参与、多条信号转导途径独立或交联形成的复杂调控网络。因此，炎症时PMN凋亡信号转导通路和相关基因的变化是揭示PMN凋亡延迟机制的关键所在。

    细胞凋亡主要信号转导通路包括：线粒体途径、死亡受体途径及caspase-12内质网激活途径，在PMN中死亡受体通路（Fas/FasL）是促进凋亡的基本通路。因此，为了研究ECC下心脏手术中的凋亡延迟机制，我们对PMN细胞膜上Fas的表达的变化进行观察。研究结果显示PMN膜上Fas的阳性表达细胞数在停ECC后30 min降低，术后24 h有所升高，说明已经开始恢复。Fas表达的下调，提示PMN的凋亡延迟可能与Fas/FasL介导的信号转导通路有关。Fas的作用在机体清除受病原体感染而活化的免疫细胞过程中是必需的，因此Fas表达障碍，将不能有效清除活化的炎性细胞，导致过度炎性反应和自身免疫紊乱；而Fas基因的超量表达，也将引起多种炎性细胞和实质细胞的过度凋亡。另有研究表明，Fas和FasL基因的调节紊乱所引起的免疫和炎性细胞凋亡信号改变可能是SIRS和多脏器功能不全综合征（MODS）发生的一个重要机制，Fas介导的免疫或实质细胞的程序化死亡与MODS和脓毒症发生及预后有关［4］。此外，ECC过程中过量释放的炎性因子如TNF-α、IFN-γ、IL-8、LPS等，可通过调控Fas等凋亡基因的表达从而抑制PMN的凋亡［5］。因此，可以通过调节PMN Fas的表达来对抗停ECC后凋亡延迟，减轻由于PMN的过度活化而导致的过度炎性反应。目前就有一种白细胞抑制装置（leukocyte inhibition module，LIM），通过血液和免疫调节生物膜的短暂接触，激活Fas，使PMN在短时间内失活。一项猪的载体动物实验中将其连接于管路动脉端，就没有观察到PMN的凋亡延迟，认为LIM能够显著抑制PMN的激活［6］。

 成熟的PMN表达的Bcl-2家族有抗凋亡和促凋亡两类蛋白，它们是与线粒体途径相关的主要调节因素。在炎性条件下，由于NF-κB的激活诱导抗凋亡蛋白的合成增加，在与促凋亡蛋白的较量中占上风［7］。因此，我们选择Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2作为研究对象。

    研究结果显示PMN胞内Bcl-2的阳性表达细胞百分数，与ECC前比较ECC开始后30 min、停ECC后30 min、术后24 h依次升高，表明PMN胞内Bcl-2表达上调。Bcl-2作为一种凋亡抑制蛋白，被认为是细胞凋亡调控的最后通路之一。由此可见，PMN胞内Bcl-2表达的上调，可能是PMN凋亡受到抑制的机制之一。

    综上所述，小儿ECC多种非生理性因素使PMN凋亡受到抑制，其机制与PMN的Fas表达下调和Bcl-2表达上调有关，为今后从PMN凋亡调控入手防治ECC引发SIRS提供了新思路。

【参考文献】  ［1］ Haslett C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation［J］. Am J Respir Crit Care Med, 1999, 160(5 Pt 2):S5-11.

［2］ Sakai Y, Watanabe T. Inflammatory response during cardio- pulmonary bypass: neutrophil apoptosis［J］. Kyobu Geka, 1998, 51(12):1024-1026.

［3］ Chello M,Mastroroberto P,Quirino A,et al.Inhibition of neutrophil apoptosis after coronary bypass operation with cardiopulmonary bypass［J］.Ann Thorac Surg, 2002,73(1):123-130.

［4］ Papathanassoglou ED, Moynihan JA, McDermott MP, et al. Expression of Fas(CD95) and Fas ligand on peripheral blood mononuclear cells in critical illness and association with multiorgan dysfunction severity and survival［J］. Crit Care Med, 2001, 29(4):709-718.

［5］ Scholz M, Simon A, Berg M, et al. In vivo inhibition of neutrophil activity by a FAS(CD95) stimulating module: arterial in-line application in a porcine cardiac surgery model［J］. J Thorac Cardiovasc Surg, 2004, 127(6):1735-1742.

［6］ Dunican AL, Leuenroth SJ, Grutkoski P, et al. TNF alpha- induced suppression of PMN apoptosis is meliated through interleukin-8 production［J］. Shock, 2000, 14(3):284-288.

［7］ Akgul C, Moulding DA, Edwards SW. Molecular control of neutrophil apoptosis［J］. FEBS Lett, 2001, 487(3):318-322.