胸腔积液蛋白质图谱差异及其临床意义初探

作者：汪得喜    作者单位：广州市红十字会医院 呼吸内科; 医学实验中心，广东 广州510220

　　【摘要】  目的 探讨表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术 (SELDITOFMS技术)对胸腔积液鉴别诊断的价值。方法 用SELDITOFMS技术检测33例诊断明确的胸水标本及部分相应血清标本。 结果 良恶性胸腔积液组血清标本蛋白信号无明显差别，但胸液标本有6个蛋白信号有差异；胸液中存在的M3945.52 Da、 M8944.86 Da蛋白差异对渗出性胸液的良恶性判断有鉴别价值；漏出性胸液及其相应血清标本蛋白含量和成分差异较大，无分析价值。结论 SELDITOFMS技术对渗出性胸腔积液的良恶性鉴别有实用前景。

　　【关键词】  胸腔积液 良恶性 生物学标记 质谱法 SELDITOFMS技术

　　胸液分析是对胸腔积液进行鉴别诊断的重要内容。目前进行的胸液分析主要有显微镜检查、生化分析、酶活性测定、免疫学检查以及细胞学检查等，但存在敏感性、特异性或鉴别效能等方面问题［1-4］。表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术 (SELDITOFMS) 是一种可直接检测相对原始生物样品的高效、高通量、高灵敏度的蛋白质组学研究技术平台，也是目前进行比较蛋白质组学研究的核心技术［5］。笔者使用SELDITOFMS技术检测了33例诊断明确的胸腔积液患者胸水标本及部分相应血清标本，比较其蛋白质成分异同，以探讨其临床价值。 　　1  对象与方法

　　1.1  诊断标准     　　(1) 癌性渗出性胸腔积液: 胸水生化检查符合Light渗出液标准，胸液细胞学检查发现肿瘤细胞，同时存在原发肿瘤病灶的证据；(2) 良性渗出性胸腔积液:临床上缺乏恶性胸腔积液证据，胸水生化检查符合Light渗出液标准，经相应治疗后胸液吸收同时随访半年以上无复发；（3）漏出液：临床存在心衰、肝硬化、低蛋白血症等情况，胸水生化检查符合Light漏出液标准。

　　1.2  对象    　　共33例胸水病人，其中男性24例，女性9例；年龄22～90岁。胸水生化检查符合Light渗出液标准27例，其中良性胸腔积液组13例，男10例,女3例,年龄22～69岁。恶性胸腔积液组14例，其中男11例,女3例,年龄42～90岁；原发肿瘤分别为肺癌、胸膜间皮瘤、鼻咽癌；胸液中找到腺癌细胞4例、间皮瘤细胞2例、低分化腺癌、黏液腺癌及小细胞癌各1例、不能确定细胞类型5例。符合漏出液标准6例，其中男性3例,女3例,年龄56～75岁。

　　1.3  标本获取及处理方法    　　在第1次或第2次胸腔穿刺时留取5 mL胸液标本，2 h内以3 500 r/min低温离心10 min分离出上清液后置-80 ℃冰箱保存备测；同时抽取5 mL静脉血以同样方式离心分离出血清后置-80 ℃冰箱保存备测。

　　1.4  主要仪器和试剂    　　检测所用的PBSIIc型SELDITOFMS仪及WCX2型弱阳离子蛋白质芯片由美国Ciphergen公司生产；所用的主要试剂有：尿素；2mmol/L TrisHCl pH9（Sigma公司）；乙腈（acetonitrile, ACN，Sigma公司）；三氟乙酸（TFA， Sigma公司）；DTT（Sigma公司）；3环乙胺11丙磺酸（CHAPS，Sigma公司）；SPA（Sinapic acid, for MALDIMS, for mass spectroscopy，瑞士Fluka公司）。

　　1.5  检测方法及步骤

　　1.5.1  胸积液和血清样品的预处理  (1）从-80℃冰箱中取出样品，室温快速溶解；(2）取样品3 μL，用6 μL U9缓冲液稀释，冰浴30 min；(3）稀释样品中加入108 μL WCX2结合缓冲液，混匀即可。

　　1.5.2  蛋白质芯片的制备  (1）将WCX2芯片装入芯片处理器，每孔加入200 μL WCX2结合缓冲液，置摇床130 r/min，震荡5 min，吸去缓冲液。重复上述操作一次。(2）每孔中加入100 μL预处理后的样品，置摇床130 r/min，震荡1 h，吸去样品。(3）每孔加入200 μL WCX2结合缓冲液，置摇床130 r/min，震荡5 min，吸去缓冲液。重复上述操作一次。(4）每孔加入200 μL HPLC grade水，稍加振荡，即刻吸出。(5）拆开芯片处理器，取出芯片，风干。(6）在芯片每点加入1 μL SPA溶液，风干。

　　1.5.3  蛋白质芯片的测定  将制备完成的芯片装入SELDI质谱仪芯片仓，设置测试条件如下：(1）最高分子量60 000 Da（道尔顿），优化分子量范围：2 500～20 000 Da；(2）激光强度200（最高240）；(3）检测器灵敏度8（最高10）；(4）分子量过滤器设于1 000 Da（滤去1 000 Da以下小分子，减弱小分子对检测器的干扰）；(5）扫描芯片表面20％～80％部分，步进4％，每点扫描7次；自动收集数据。

　　1.5.4  共检测33例胸液标本，16例血清标本（良性胸液5例，恶性胸液8例，漏出液3例）。非同日分3批检测完成。

　　1.6  数据分析和统计

　　1.6.1  分类模型的建立  将检测获得的胸液和血清蛋白质指纹图谱用Ciphergen ProteinChip Software拉平基线，校正分子量和总离子强度。随后使用Biomarker Wizard Software（Ciphergen公司）筛选出信噪比大于4的信号，将这些信号导出成电子表格文件，再导入Biomarker Patterns Software（BPS，Ciphergen公司）进行分类运算，得出分类模型。

　　1.6.2  分类模型的灵敏度及特异性分析  利用BPS自带的TEST模式功能将建分类模型的数据随机分成两组，一部分建模，一部分做盲测，如此多次随机的测试来计算出现实情况下分类模型的对良恶性胸液判别的灵敏度和特异性。

　　2  结果

　　2.1  差异蛋白质峰  根据设置的测试条件，共获得225个可供分析的蛋白电离信号。比较发现良恶性胸腔积液组血清标本蛋白信号没有明显差别，但胸液标本有6个蛋白信号呈现差异，分别是M3164.21、M3945.52、M8944.86、M11340.9、M13573.7、M30917.8 Da蛋白，其中以M3945.52、M8944.86 Da蛋白与胸液分类相关性最为密切，见图1。

　　M 恶性胸腔积液  B 良性胸腔积液

　　图1  良恶性胸腔积液患者M3945.52、M8944.86 Da蛋白差异峰（箭头所示) （略）

　　Tab.1  The differences of  M3945.52、M8944.86Da protein signals between benign and malignant pleural effusions (arrow）

　　2.2  蛋白质指纹图谱筛选模型  利用BPS软件对所获得的蛋白信号资料进行分析后，可分别建立以M3945.52Da或M8944.86Da蛋白为标志物的良恶性胸液蛋白质图谱筛选模型，见图2。

　　Class=0 恶性胸腔积液  Class=1 良性胸腔积液  N 样品数  M 分子质量

　　图2  利用BPS建立的M3945.52 Da、M8944.86 Da蛋白图谱筛选模型（略）

　　Tab.2  Proteomic screen pattern of M3945.52 Da、M8944.86 Da established with BPS         　　如图2所示，节点（node）1为根节点，如果胸液样本中分子量为M3945.52 Da的蛋白质相对含量≤8.367，则被划入恶性胸腔积液的终节点，反之则划入良性胸腔积液的终节点。同样，如果胸液样本中分子量为M8944.86 Da的蛋白质相对含量≤16.252，则被划入恶性胸腔积液的终节点，反之则划入良性胸腔积液的终节点。

　　2.3  判别效能  将具有差异的6个蛋白质信号资料分别导入BPS软件系统进行分类运算显示：若以胸液中 M3945.52 Da蛋白相对含量等于8.367为界，可将84.6%的良性胸液样本及91.8%恶性胸液样本正确识别，其特异性分别为83.3%、84.6%；若以胸液中M8944.86 Da蛋白相对含量等于16.252为界，可将84.6%的良性胸液样本及78.6%的恶性胸液样本正确识别，其特异性分别为83.3%、76.9%；其他4种蛋白的标本分类正确率及特异性均在50%以下。

　　2.4  漏出性胸液    　　6例漏出性胸液及其相应血清标本蛋白含量和成分差异较大，不能进行有效的差别分析。

　　3  讨论        　　胸腔积液的形成与水、钠潴留、低蛋白血症、肺毛细血管压增高、胸膜毛细血管通透性增加、胸膜腔淋巴引流阻塞等有关［1］。其中水、钠潴留、低蛋白血症、肺毛细血管压增高引起的胸腔积液多为漏出液，临床上病因主要有充血性心力衰竭、肝硬化、肾病综合征等情况；其他情况引起的胸腔积液多为渗出液，临床上病因多种多样，主要有肿瘤性、感染性、化学性、变态反应性等因素。由于渗、漏出液的病因及形成机理不同，通过对胸液的生化分析，结合临床表现及Light判别标准不难将两者鉴别，常不需借助其他鉴别检查手段。本研究使用SELDITOFMS技术分析了6例漏出性胸液蛋白图谱，发现图谱差异巨大，难以进行比较分析，表明SELDITOFMS技术分析漏出液中蛋白质图谱差异应用价值极为有限。       　　渗出性胸腔积液的病因分布差异较大，其中肿瘤转移或原发胸膜恶性肿瘤所致的胸腔积液预后较差，一般称之为恶性胸腔积液；其他病因引起的预后较好，则称之为良性胸腔积液。目前临床上鉴别良恶性胸液的手段有胸液酶活性测定、免疫学检查、细胞学检查、胸膜活检以及胸腔镜等，其中胸液酶活性测定、免疫学检查、细胞学检查、胸膜活检最为常用，但都存在一定的局限性，文献报道有10%～17%的胸腔积液病因不能得到及时诊断［3,4］，胸腔镜检查虽然有较高的诊断价值，但开展需要一定技术及设备条件，病人所遭受的痛苦也较大，难以普遍开展，渗出性胸腔积液的病因诊断一直成为临床上具有挑战性的问题。        　　SELDITOFMS技术又称为蛋白质芯片技术或蛋白指纹技术，由蛋白质芯片系统和质谱仪组成，具有可直接检测血清、尿液、组织和细胞裂解物等原始样本。是目前常用的差异蛋白质组研究方法之一［5］ ，通过比较不同疾病情况的蛋白质谱的差异，发现样本中与某种疾病或环境因素损伤可能相关的特异性蛋白质信息，为临床诊断或进行进一步的基础研究提供依据。       　　本研究应用SELDITOFMS检测了27例渗出性胸液标本及部分相应的血清标本，对获得的蛋白信号进行分析发现：良恶性胸腔积液组血清标本蛋白信号没有明显差别，但胸液标本有6个蛋白信号呈现差异。利用Biomarker Patterns软件对所获得的胸液蛋白图谱进行分析，建立的M3945.52 Da、M8944.86 Da蛋白图谱筛选模型可将80%左右的良恶性胸液正确判别，表明使用SELDITOFMS技术在胸腔积液的良恶性判别中具有应用前景。       　　本研究的主要目的是探讨SELDITOFMS技术应用于良恶性胸液鉴别的可能性，由于病例数有限，因此研究结果只限于表明SELDITOFMS技术在胸腔积液的良恶性鉴别中具有应用前景，至于研究中所发现的蛋白质差异在更多病例中情况如何尚难肯定，这也是我们下一步即将进行的工作。    　　致谢：本研究部分标本来自广州市第二人民医院、广州市胸科医院，特此致谢！ 

　　【参考文献】  　 ［1］高育瑶.实用内科学［M］.10版.北京：人民卫生出版社，1997：1 475-1 479.

　　［2］ MOHANTY S K, DEY P. Serous effusions: diagnosis of malignancy beyond cytomorphology an analytic review［J］. Postgrad Med J, 2003,79(936):569-574.

　　［3］ 樊英,李龙芸.良恶性胸腔积液的鉴别诊断［J］ .癌症进展杂志, 2005,3(2):135-138.

　　［4］李少文,王文莉,马琼凤,等 .1 000 例胸液腺苷脱氨酶检测结果随访分析［J］.医师进修杂志(内科版), 2005,28(5):22-23.

　　［5］孙言伟，贺颖，贺福初 .差异蛋白质组学的研究进展［J］. 生命科学,2005,17（2）：137-140.