大鼠脑梗死后缺氧组织显像的动态变化

　　作者：潘经锐， 王艺东， 李 梅， 黎祥喷， 彭 英 作者单位：(中山大学附属第二医院神经内科，广东广州，510120)

　　【摘要】 【目的】 研究大鼠脑梗死后缺氧组织是否能长期存在及其动态变化。 【方法】 利用大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，分别采用99Tcm-HL91放射自显影和EF5免疫荧光的方法进行缺氧显像。分持续缺血组(PI)、1.5 h缺血再灌注组(1.5 h IR)、2 h缺血再灌注组和3 h缺血再灌注组4组，放射自显影的观察时间点选取手术后1 d和14 d，免疫荧光则选取术后1、3、7、14、21 d，每个时间点各3只大鼠。 【结果】 放射自显影显示1.5 h IR组手术后1 d和14 d均为缺氧阳性，其余各组均阴性;免疫荧光示1.5 h IR组术后1、3、7和14 d均有缺氧组织，面积(?滋m2)有缩小倾向(分别为21 478 ± 8 254、 4 405 ± 1 490、2 647 ± 463和1 612 ± 239)，但荧光强度没有明显减弱(分别为1.66 ± 0.07、1.75 ± 0.02、1.68 ± 0.08和1.64 ± 0.01);而其余各组在术后7 d均已无缺氧组织。 【结论】 与人类脑梗死相似，大鼠脑梗死后缺氧组织可存在较长时间，且随着时间的延长而逐渐减少;1.5 h IR的大鼠MCAO模型是研究脑梗死后缺氧组织长时间存在的合适模型。

　　【关键词】 缺氧; 脑梗死; 放射性自显影; 免疫荧光; EF5; 99Tcm-HL91

　　Dynamic Imaging Changes of Hypoxic Tissues after Cerebral Infarction in Rats

　　PAN Jing-rui， WANG Yi-dong*， LI Mei， LI Xiang-pen， PENG Ying

　　(Department of Neurology， The Second Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China)

　　Abstract： 【Objective】 To investigate whether the hypoxic tissue could be long-standing after cerebral infarction in rat and how it changed with the lapse of time. 【Method】 The hypoxic tissues after cerebral infarction in rats were detected using radioautography (99Tcm-HL91) and immunofluorescence (EF5) respectively in MCAO models of rats. Rats were randomly divided into four groups for each method： (1) persistent ischemia (PI)， (2) 1.5 h ischemia-reperfusion (1.5 h IR)， (3) 2 h ischemia-reperfusion， (4) 3 h ischemia-reperfusion. Radioautography was performed on day 1 and day 14 post-operation. Immunofluorescence was detected on day 1， 3， 7， 14， and 21 post-operation， respectively. Three rats were sacrificed at each time point for each group. 【Results】 Radioautography showed that hypoxia imaging was positive in 1.5 h IR group on both day 1 and day 14. And immunofluorescence showed that hypoxic tissues were observed from day 1 to day 14 in 1.5 h IR group， but the area of hypoxic tissue (um2) gradually decreased (21 478 ± 8 254， 4 405 ± 1 490， 2 647 ± 463， and 1 612 ± 239， respectively)， while the average optical density remained nearly the same(1.66 ± 0.07， 1.75 ± 0.02， 1.68 ± 0.08， and 1.64 ± 0.01， respectively) with the lapse of time. However， hypoxic tissue disappeared from day 7 in the other groups. 【Conclusions】 The hypoxic tissue in the ischemic hemisphere could be long-standing but gradually decreased with the lapse of time in rats as well as in human beings. And the 1.5 h IR model of rat was a suitable model for studying the long-termed hypoxic tissue after cerebral infarction.

　　Key words： hypoxia; cerebral infarction; radioautography; immunofluorescence; EF5; 99Tcm-HL91

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2009，30(5)：605-610]

　　脑梗死后，缺血周边区功能受影响但结构尚完整的组织，常称为“缺血半暗带”，是治疗的主要靶点[1]。近年的研究发现脑梗死灶周围存在缺氧组织。缺氧组织是指组织的氧浓度介于正常与无氧之间，且功能异常，而尚无明显形态学改变;与缺血半暗带的概念相似。缺氧组织可通过缺氧显像的方法显示。尽管有研究认为脑梗死后早期存在的缺氧组织可能代表缺血半暗带[2]，但也有研究发现缺氧组织的持续时间远长于一般认为的缺血半暗带最长存在时间(40余h)：冯珏等[3]的观察结果是3 ～ 5 d，Song等[4]的研究报告是6 ～ 14 d，而我们的观察最长至44 d[5-6]。这让人对缺血半暗带的持续时间和缺氧组织是否能代表缺血半暗带产生了疑惑。而且以往几乎所有的关于脑梗死后缺氧显像的实验研究都只是研究脑梗死后24 h内的缺氧情况，并没有观察长时间存在的缺氧组织的研究报告。因此，本实验的目的在于：①模拟人类脑梗死过程，利用大脑中动脉缺血再灌注的大鼠线栓模型验证缺氧组织是否可长时间存在;②观察脑梗死后缺氧组织的动态变化;③筛选出缺氧组织存在时间最长的大鼠缺血再灌注模型。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组

　　取健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠120 只，清洁级，体质量280 ～ 330 g(由中山大学实验动物中心提供，合格证号：NO.0036315，0032883，0033310，0033209)，放射自显影分4组：持续缺血组(persistent ischemia，PI)、1.5 h缺血再灌注组(1.5 h ischemia-reperfusion，1.5hIR)、2 h缺血再灌注组(2 h ischemia-reperfusion，2hIR)、3 h缺血再灌注组(3 h ischemia-reperfusion，3hIR)，按缺氧显像开始的时间不同，每组再分两个亚组：术后1、 14 d亚组，每个亚组3只大鼠。免疫荧光同样分4组：PI组、1.5hIR组、2hIR组和3hIR组;每个小组再分为5个亚组：术后1、3、7、14、21 d亚组，每个亚组3只大鼠;免疫荧光法缺氧显像从术后1 d亚组开始进行，顺序往后，如果前一亚组缺氧显像阳性，则继续下一亚组的缺氧显像;否则取消后面亚组的缺氧显像。

　　1.2 大鼠脑缺血再灌注模型的建立

　　参考Longa氏方法[7]，行右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion， MCAO)[8]，稍加改良。持续缺血组不拔栓线。再灌注组则在相应再灌注时间点时将栓线拔出至颈外动脉内实现再灌注。大鼠清醒后出现左上肢瘫痪、转圈、追尾征等为成功模型。

　　1.3 宏观放射自显影

　　缺氧显像剂为锝(99Tcm)标记的4 ，9-二氮-3，3，10，10-四甲基十二烷-2，11-二酮肟[4，9-diaza-3，3，10，10-tetramethyldodecan-2，11-dione dioxime(BnAO)，HL91]。Na99TcmO4新鲜淋洗液由中国原子能科学研究院广州医用同位素中心提供; HL91由北京欣科思达医药技术有限公司提供。按该公司提供的标记与鉴定方法，99Tcm标记HL91的方法为一步法，标记率在95%以上。

　　在各观察时间点，将99Tcm-HL91 185 MBq 0.5 mL 由股静脉注入每只大鼠体内。4 h后以10%KCl溶液尾静脉注射处死动物，迅速开颅取脑，置于 -20 ℃ 恒冷冰箱中冷冻30 min，再自视交叉平面开始进行冠状面间断连续冰冻切片，每隔0.2 mm切一张片，每个标本切4张片，片厚度取20 ?滋m，依次贴于载波片上，置于60 ℃的烘箱内烘干10 min。取出烘箱内切片移入暗室，用接触法将切片与氚片贴紧，置于含干燥剂的暗盒中，4 ℃条件下曝光24 h，最后进行显影、定影处理。曝光完毕后，再取组织切片进行HE染色。通过染色后的组织切片与氚片原位重叠以定位缺氧组织。氚片上有黑色银颗粒为缺氧阳性。

　　1.4 免疫荧光法缺氧显像

　　1.4.1 染色过程 缺氧显像剂为2-(2-硝基-1氢-咪唑-1-羟基)-氮-(2，2，3，3，3-5氟嘌呤)乙酰唑胺[2-(2-nitro-1H-imidazole-1-yl)-N-(2，2，3，3，3-pentafluoropropyl) Acetamide，EF5]，由美国宾夕法尼亚大学的Cameron J Koch教授馈赠。在观察时间点，将EF5溶液(3 mg/mL，以生理盐水溶解，现配现用)按30 mg/kg大鼠体质量的剂量从尾静脉缓慢注射进大鼠体内;4 h后麻醉大鼠，分别以250 mL冰生理盐水和150 mL 40 g/L多聚甲醛缓慢心脏灌注(见大鼠出现肢体抽搐为佳);开颅取脑;标本以40 g/L多聚甲醛4 ℃固定6 h，最后经梯度蔗糖脱水处理。脱水处理后的标本经 -20 ℃ 速冻30 min，OCT包埋，然后每个标本以视交叉平面为中心间断连续切片，每切2张，然后隔1 mm再切2张片，共10张片，片的厚度为10 ?滋m;相邻的两张片分别行免疫荧光法缺氧显像的普通染色和竞争对照染色(各4张);每个标本各取一张片行HE染色，另取一张行空白对照染色。

　　普通染色组(Regular EF5 Stain， RS)：切片先以50 mL/L BSA室温封闭1 h;再先后以ttPBS和PBS浸泡，擦去周围液体，加Cy3标记的EF5抗体ELK3-51(75 ?滋g/mL)，避光、4 ℃孵育6 h; ttPBS泡45 min × 2，PBS泡45 min × 1;最后以体积分数50%的甘油封片。

　　EF5竞争对照染色组(Competed EF5 Stain，CS)：用以鉴别缺氧真阳性和假阳性，以Cy3-ELK3-51 Competed 溶液(成分包括EF5及Cy3标记的ELK3-51，EF5浓度远高于ELK3-51)代替Cy3-ELK3-51，余过程同上。

　　空白对照组(Blank Control， BC)：切片不加抗体孵育，直接以PBS 4℃孵育6 h，甘油封片。

　　1.4.2 荧光观察 在荧光显微镜下观察组织切片，呈现红色荧光的组织，与CS对比排除假阳性后，确定为缺氧组织。为方便统一在荧光显微镜下观察缺氧组织，拟将组织切片中梗死侧大脑半球的梗死灶周围皮质区域分为4个区，依次划分为A、B、C和D区(图1)，显微镜下均以 × 200的倍数对每个区域进行观察。

　　1.4.3 图像分析 利用Image Pro Plus6.0专业图像分析软件(由Media Cybernetics公司提供)测定每张切片中荧光的累积面积(ASUM)和累积光密度(DIO，SUM)，则该张切片的平均光密度可由DIO，SUM/ASUM比值求得。对每个亚组所有组织切片中的ASUM和平均光密度分别进行统计平均，即得到该亚组缺氧组织的平均面积和平均光密度。

　　1.5 统计学分析

　　利用SPSS 11.5统计软件包对结果进行分析。对每个小组内不同亚组的数据进行纵向比较，对不同小组内、相同观察时间点缺氧显像的亚组进行横向比较，采用one-way ANOVA及SNK-q检验(方差齐性)或者Kruskal and Wallis test(方差不齐)方法;两两比较采用两个独立样本的t检验(方差齐性)或者秩和检验(方差不齐)方法。结果用(x ± s)表示，P < 0.05认为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 放射自显影

　　1.5hIR组1 d和14 d亚组的曝光的氚片上均见黑色的银颗粒，为缺氧阳性，与HE染色的组织片重叠后显示，缺氧组织均位于梗死侧大脑半球的边缘皮质，呈条状(图2)。其余各组均未见氚片上有银颗粒，为缺氧阴性。

　　2.2 免疫组化荧光和HE染色

　　1.5hIR组术后1、3、7、14 d均见缺氧组织，21 d无缺氧组织。而其余各组仅在术后1 d和3 d可见缺氧组织。缺氧组织成片状或条状，多位于梗死侧大脑半球的外侧周围皮质(A、B、C区，图3)。

　　1.5hIR组术后14 d HE染色显示，缺血中心区可见较多筛网状软化灶形成，正常细胞核罕见，细胞轮廓模糊;而周围皮质(缺氧组织所在相应区域)细胞核形态基本正常，细胞轮廓存在，细胞碎片或者核皱缩现象很少，说明该区域细胞尚未发生坏死或凋亡(图4)。

　　各亚组缺氧组织的平均面积见表1。1.5hIR组内各亚组的缺氧组织平均面积随着时间延长逐渐缩小，但3 d亚组和7 d亚组比较没有统计学差异(P = 0.065)，其余各亚组两两比较均有统计学差异(P < 0.05);2hIR组、3hIR组和PI组3 d的缺氧组织平均面积均较1 d时小，两者比较均有统计学差异(P < 0.05)。对各组术后1 d亚组的缺氧组织平均面积进行比较，没有统计学差异(P = 0.844);各组术后3 d亚组的缺氧组织平均面积比较，3hIR组的最小，与其余各组比较均有统计学差异(P < 0.05)，但其余各组间比较均没有统计学差异(P = 0.662)。

　　各亚组缺氧组织的荧光平均光密度见表2。1.5hIR组和PI组组内各亚组之间比较均无统计学差异(P = 0.075和0.126); 2hIR组和3hIR组术后1 d亚组的平均光密度比3 d亚组的高(P = 0.001和0.007)。各组术后1 d亚组的缺氧组织的平均光密度比较，没有统计学差异(P = 0.536);各组术后3 d亚组的缺氧组织的平均光密度比较，3hIR组的最小，与其余各组比较均有统计学差异(P < 0.05)，而其余各组间比较均没有统计学差异(P = 0.153)。

　　3 讨 论

　　缺血半暗带是脑梗死治疗的主要靶点，临床上仍然缺少简便、可靠的确定半暗带的方法。近年来应用缺氧显像方法显示缺氧组织成为半暗带研究的一个新的方向。一些作者的研究认为，脑梗死后早期出现的缺氧组织可代表半暗带[2，9]。而另一些临床研究则发现部分脑梗死患者急性期过后仍然存在缺氧组织[3-6]。这些缺氧组织是否像半暗带一样是有价值的治疗靶点，目前仍然缺少组织学的证据。本研究利用大鼠MCAO缺血再灌注的模型，采用两种缺氧显像方法，均观察到脑梗死后14 d缺氧组织仍存在，与人类脑梗死的观察类似。据所查文献，这是首次在动物模型上证实脑梗死后缺氧组织可长时间存在，为研究脑梗死后复杂的病理生理过程提供了新的途径。

　　本研究发现缺血1.5 h后再灌注的模型的缺氧组织可较长时间存在(14 d)，而缺血2 h或以上缺氧组织则仅短时间存在(3 d)。再灌注情况和侧枝循环可能是造成这种差异的2个主要原因。已有研究观察到，缺血75 min内再灌注，24 h后缺氧组织基本消失[10];而缺血2 h后再灌注，24 h时缺氧组织已很少[9]。说明再灌注的时机对缺氧组织的转归有重要影响。Noto等[11]还观察到即使MCA再通，缺氧组织仍持续存在，同时发现邻近组织血小板和粒细胞明显增多，推测由于血小板和粒细胞堵塞血管，致血流灌注不良，组织仍处于缺氧状态。此外，侧枝循环也可能是影响缺氧组织转归的一个重要因素。侧枝循环的建立在发病早期依靠原有血管网的开放，而后期则主要依赖于血管的新生。新生血管的数量从脑梗死后第3天开始增多，可一直持续到21 d以后[12];因此在14 d内，也许新生的血管虽可以补偿部分的血液灌注，但由于所需的血管密度仍然尚未形成，缺氧组织可获得部分的血液灌注而不至于坏死，但尚不足以恢复到正常状态，所以缺氧仍然存在;而21 d后，所需的血管密度已经形成，原缺氧区域得到了从新生血管提供的足够的血液灌注，因此缺氧消失。

　　本实验所观察到的缺氧组织只持续至术后14 d，比临床观察到的最长时间44 d短[5]。原因可能是：脑梗死患者几乎都为中老年人，多合并动脉粥样硬化、高血压、糖尿病和高脂血症等影响血管增生和侧枝循环开放的因素，因此在脑梗死亚急性期其血管增生和侧枝循环的建立仍不足以提供足够的血液循环，致使部分组织仍然处于缺氧状态;而本实验中的大鼠均体健且处于青壮年时期(7 ～ 8周龄)，没有其他血管病变因素，因此在脑卒中发生后其血管增生和侧枝循环建立较充分，致使缺氧组织较快消失。如果实验中选取的是高血压大鼠的MCAO模型，则缺氧组织的持续时间可能会更长、更接近临床试验的结果。

　　实验结果显示，随着发病时间的延长，缺氧组织的面积不断缩小，说明缺氧组织在不断地消失，最终存活下来或凋亡、坏死;此外，缺血2 h或以上缺氧组织均只持续3 d，说明缺血2 h以上再灌注与持续缺血导致的组织死亡无明显差别，这与国外的报道相符合[13]，而与目前认为人类脑梗死后存在长达3 ～ 6 h的再灌注治疗时间窗的不同，可能是由于物种之间的差异所致。

　　除了1.5hIR组和PI组，其他两组的缺氧组织随着时间的延长，其荧光强度(平均光密度)均迅速减弱，这与缺氧组织在不断死亡或缺氧被改善有关;而1.5hIR组内各亚组荧光强度并没有随着时间的延长而有明显的改变，说明1.5 h缺血再灌注这种处理因素能让梗死灶的周围皮质长时间处于缺氧状态。

　　我们在临床研究中将缺氧显像和脑组织葡萄糖代谢显像相结合，通过对同一患者的动态显像，观察到缺氧组织到底存活下来还是最终死亡[5]。本研究HE染色显示，1.5hIR组14 d缺血侧皮质的细胞轮廓和细胞核形态仍然是正常的，但该部分的缺氧组织面积已明显缩小，说明该缺氧组织已恢复正常;缺血2 h以上组7 d和14 d时缺氧组织已消失，而缺血2 h以上的最终梗死体积和持续缺血相同，说明其中有部分缺氧组织最终死亡。

　　本实验也存在不足之处：3hIR组3 d亚组的缺氧组织平均面积和平均光密度与其他各组3 d亚组比较均最小， PI组内两个亚组的平均光密度没有统计学差异，这些是否与实验误差有关，还是另有原因，需进一步的研究。

　　综上所述，本研究证实了脑梗死后缺氧组织可以长时间存在，但与血管再通的时间有关;而随着发病时间的延长，缺氧组织逐渐消失。同期HE染色显示缺氧组织区域的细胞结构是正常的，说明缺氧组织仍然存活;这提示临床上对于脑梗死亚急性期的病人仍然有必要进行缺氧组织的检查，对于缺氧阳性的患者，也许积极的治疗仍然十分必要，因为这些缺氧组织有可能恢复到正常。虽然本实验无法证实缺氧组织就是通常认为的缺血半暗带，但也说明长时间存在的缺氧组织仍然是一个有价值的治疗靶点。本研究也表明1.5 h IR的大鼠MCAO模型是研究脑梗死后缺氧组织长时间存在的合适模型。

　　【参考文献】

　　1 Donnan GA， Fisher M， Macleod M， et al. Stroke [J]. Lancet， 2008，371(9624)：1612-1623.

　　2 Read SJ， Hirano T， Abbott DF， et al. Identifying hypoxic tissue after acute ischemic stroke using PET and 18F-fluoromisonidazole[J]. Neurology， 1998，51(6)：1619-1621.

　　3 冯 珏，冯亚青，边艳珠，等. 新型缺氧显像剂99Tcm-HL91在缺血性脑血管病中的试验研究 [J]. 中国医学影像技术，2003，19(2)：164-166.

　　4 Song HC， Bom HS， Cho KH， et al. Prognostication of recovery in patients with acute ischemic stroke through the use of brain SPECT with Technetium-99m——labeled metronidazole [J]. Stroke， 2003，34(4)：982-986.

　　5 王艺东，刘 生，黎祥喷，等. 脑梗死患者的99mTc-HL91 SPECT缺氧显像[J]. 国际脑血管病杂志，2007，15(1)：33-37.

　　6 刘 生，王艺东，卢献平，等. 99Tcm-HL91脑缺氧显像检测急性脑卒中患者缺氧脑组织及其意义 [J]. 中山大学学报：医学科学版，2006，27(5)：590-593.

　　7 Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion craniotomy in rats [J].Stroke，1989，20(1)：84-91.

　　8 向秋玲，陈健文，马仁强，等. 三七中人参三醇皂苷对脑缺血的保护作用 [J]. 中山大学学报：医学科学版， 2008，29(06)：705-709.

　　9 Saita K， Chen M， Spratt NJ， et al. Imaging the ischemic penumbra with 18F-fluoromisonidazole in a rat model of ischemic stroke [J]. Stroke，2004，35(4)： 975-980.

　　10 Spratt NJ， Ackerman U， Tochon-Danguy HJ， et al. Characterization of fluoromisionidazole binding in stroke [J]. Stroke， 2006，37(7)：1862-1867.

　　11 Noto T， Furuich Y， Ishiye M， et al. Temporal and topographic profiles of tissue hypoxia following transient focal cerebral ischemia in rats[J]. J Vet Med Sci，2006，68(8)：803-807.

　　12 Hayashi T， Noshita N， Sugawara T， et al. Temporal profile of angiogenesis and expression of related genes in the brain after ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab， 2003，23(2)：166-180.

　　13 Smith WS. Pathophysiology of focal cerebral ischemia： a therapeutic perspective[J]. J Vasc Interv Radiol，2004，15(1 pt 2)：S3-12.