炎性脱髓鞘疾病患者S100b和MBP的检测及其意义

　　作者：吕志华, 唐从峰 汪保华, 易继龙, 文 芳 作者单位：1荆门市第一人民医院神经内科,湖北 荆门 448000;2武汉大学人民医院神经精神病研究所,湖北 武汉 430060

　　【摘要】 目的:通过检测炎性脱髓鞘疾病患者脑脊液(CSF)中S100b和碱性髓鞘蛋白(MBP)的含量及其相互关系，对炎性脱髓鞘疾病的发病机制进行探讨，并对S100b的临床意义进行评价。方法:对43名多发性硬化患者(MS)、25名格林巴利患者(GBS)和39名正常对照者分别采用酶联免疫吸附试验检测脑脊液S100b水平，同时应用改良的酶联免疫吸附同步法检测MBP含量以及应用改进的Thompson聚丙稀酰胺凝胶电泳法检测寡克隆IgG区带。结果:MS组和GBS组CSF中的S100b及MBP水平均显著升高，与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)，两者具有相关性(P<0.01);两组CSF IgGOB阳性率(分别为83.7%、68.0%)也显著高于正常对照组(均为P<0.01)。结论:S100b可能参与了炎性脱髓鞘疾病的发病机制，S100b、MBP水平在一定程度上反映了脱髓鞘患者的严重程度，有助于病情预后的判断。

　　【关键词】 S100b蛋白;髓鞘碱性蛋白;脑脊髓液;多发性硬化;格林巴利综合征

　　Detection and Significance of S100b and MBP in Patients with Inflammatory Demyelinating Diseases LV Zhihua1,TANG Congfeng1,WANG Baohua1,Yi Jilong1,WEN Fang2 (1Department of Neurology, The First Renmin Hospital,Jingmen, Hubei 430071,China;2Institute of Neurological and Psychiatric,Renmin Hospital,Wuhan University,Wuhan,Hubei 430060,China)

　　Abstract: Objective To explore the pathogenesis of inflammatory demyelinating diseases and evaluate the significance of S100b in cerebrospinal fluid (CSF). Methods The S100b in CSF with 43 multiple sclerosis(MS),25 guillainbarre syndrome(GBS) patients and 39 normal controls were respectively detected with double antibody sandwich method. MBP was simultaneously analyzed with modified enzyme linked immunosorbent assay. The oligoclonal IgG zone were detected with modified Thompson method.Results Levels of S100b and MBP in CSF of MS group and GBS group were significantly higher than those of healthy control (all P<0.01),and there was a correlation between S100b and MBP. The positive rate of oligoclone IgG band(IgGOB) in MS group and GBS group was 83.7%,68.0%,respectively,and was significantly higher than that in healthy control group (all P<0.01). Conclusion S100b may play a role in pathogenesis of inflammatory demyelinating diseases,the levels of S100b and MBP in CSF could reflect the severity of patients with inflammatory demyelinating diseases, and be useful for prognosis.

　　Key words: S100b;Myelin basic protein;Cerebrospinal fluid;Multiple sclerosis;Guillainbarre syndrome

　　神经系统炎性脱髓鞘性疾病是由免疫介导的，以炎性细胞的浸润和髓鞘脱失为特点的一种常见神经系统疾病，现在普遍认为脱髓鞘疾病是神经系统异常自身免疫的结果。在脱髓鞘患者的病灶处存在着复杂的免疫炎症反应，包括细胞免疫反应和体液免疫反应的共同参与，在这些反应的过程中产生了各种细胞、蛋白、因子等，这些生物学标记物从侧面反应了脱髓鞘疾病的各种信息;S100 蛋白是一组由α和β二聚体组成的酸性钙结合蛋白,广泛存在于人体的各种组织中，目前对S100 蛋白的研究国内外已成为热点。我们应用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法对68例脱髓鞘疾病患者(43例多发性硬化患者和25例格林巴利综合症患者)和39例正常人的脑脊液(CSF)中S100b的水平进行分析，同时检测CSF中碱性髓鞘蛋白(MBP)、CSF中寡克隆IgG区带(IgGOB)，以初步探讨脱髓鞘疾病的发病机制，了解S100b在其发病机制中的作用。

　　1 资料和方法

　　1.1 研究对象

　　收集荆门市第一人民医院、武汉大学人民医院神经精神研究所脑脊液库的脑脊液标本107例，其中多发性硬化(multiple sclerosis，MS)患者43例，格林巴利综合症(guillainbarre syndrome，GBS)患者25例，正常对照组39例。

　　1.1.1 多发性硬化(MS)组:为2004年6月-2006年2月神经科住院患者43例，男19例，女24例。年龄17～71岁，平均41.2岁。其中37例确诊为MS，其余6例被确诊为视神经脊髓炎，所有患者均行MRI及其它辅助检查，包括视觉诱发电位或听觉诱发电位等确诊。患者均处于疾病活动期。

　　1.1.2 格林巴利综合症(GBS)组:同一时期在神经科住院并确诊为格林巴利综合症(GBS)活动期患者25例，男11例，女14例，年龄13～56岁，平均36.8岁。所有患者均根据临床症状。行肌电图及脑脊液检查等确诊。

　　1.1.3 正常对照组:非神经系统疾病腰麻手术患者39例，男17例，女22例，年龄23～57岁,平均39.6岁。

　　1.2 主要仪器和试剂

　　S100b检测试剂盒购于上海博光生物科技有限公司,MBP检测试剂盒购于北京科美东雅生物技术有限公司。采用Multiskan Ascent V 2.6酶联仪。

　　1.3 实验方法

　　采用酶联免疫(ELISA)法检测患者脑脊液中S100b和MBP的水平,应用改进的Thompson聚丙稀酰胺凝胶电泳法测定MS、GBS患者脑脊液中寡克隆IgG的含量。S100b和MBP的检测方法：包被酶标板,4 ℃ 48 h后取出,洗涤液洗板3次,加入脑脊液标本，不同稀释浓度的标准品为阴性对照,每孔100 μL,37 ℃ 1 h;同上洗板3 次,加检测抗体,每孔100 μL,4 ℃过夜,取出置室温1 h;洗板3次,加酶标抗体,每孔100 μL,37 ℃ 1 h;洗板3次,加显色液15～30 min后,在酶标仪410 nm处测各孔A值。绘制标准曲线,根据标准曲线计算脑脊液中S100b和MBP蛋白含量。IgG检测：先用洁净玻璃管制胶，再加脑脊液样本和一滴溴酚蓝示踪剂，电泳3 h，剥胶浸泡45 min，然后转入染色液中染色，用脱色液脱色后观察结果。

　　1.4 统计学处理

　　所有数据均为计量资料,以x±s表示,采用SPSS 12.0统计分析软件包,对患者组和对照组进行t检验和相关分析,P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　MS组、GBS组和正常对照组患者CSF中S100b和碱性髓鞘蛋白的检测结果见表1。由表1可以看出，MS患者和GBS患者CSF中S100b和MBP的水平显著高于正常对照组，差异具有显著性(均为P<0.01)。表1 三组对象CSF 中MBP检测值比较注：与正常组比较,*P<0.01由图1～2可知，炎性脱髓鞘患者S100b水平与MBP水平之间存在正相关关系(Pearson相关系数分别为r=0.446，P<0.01; r=0.507，P<0.05)。 MS组、GBS组和正常对照组患者CSF中寡克隆IgG区带的检测结果见表2，图3。表2 三组研究对象CSF IgGOB的检测由表2可以看出 MS组43名患者和GBS组25名患者中分别有36名和17名患者CSF中IgGOB检测为阳性，同时检测其血清中IgGOB均为阴性。正常对照组所有受试者脑脊液中IgGOB均为阴性。经χ2检验，MS组和GBS组IgGOB阳性率显著高于正常对照组(均P<0.01)。由图3可以看出凝胶在阴极(-)端均可见不连续区带，即为寡克隆IgG区带阳性。

　　3 讨论

　　目前认为解释炎性脱髓鞘疾病发病机制的重要学说为分子模拟(molecular mimicry)学说[1]，即患者感染的病毒与髓鞘碱性蛋白(MBP)组分或少突胶质细胞间存在共同抗原，即病毒氨基酸序列与神经髓鞘组分(MBP等)的某段多肽氨基酸序列相同或非常相近，这些病毒感染易感机体后会导致机体内的免疫细胞的激活，主要为T淋巴细胞致敏，致敏的T淋巴细胞通过血-脑屏障和血-脊髓屏障在神经系统内寻找抗原。中枢神经系统和周围神经系统的巨噬细胞吞噬髓鞘磷脂后，在HLAⅡ类分子的协助下，将与病毒抗原相同的髓鞘抗原呈递给特异性致敏的T淋巴细胞后导致T淋巴细胞的激活，激活的T淋巴细胞释放出INFγ，INFγ进一步吸引淋巴细胞在神经系统的聚集、巨噬细胞的激活并刺激免疫细胞产生各种细胞因子、自由基、蛋白溶解酶等产生炎症反应，直接或通过损伤少突胶质细胞、施万细胞等方式间接造成髓鞘的损伤引起脱髓鞘反应。

　　S100b蛋白主要分布在施万细胞、少突胶质细胞、朗汉细胞中。当含有S100b蛋白的细胞遭到破坏，S100b蛋白就释放到细胞外,进入体液，因此, S100b蛋白被认为是这些细胞损伤的标志物。S100b蛋白在细胞的增殖、分化和细胞免疫等方面扮演重要角色，S100b蛋白对中枢神经系统的炎症具有促进作用[2]，过量的S100b蛋白本身就能导致血脑屏障(BBB)的破坏，破坏的结果一方面可以促使炎症细胞进入中枢神经系统，促进炎症的发展，另一方面也可以促使外周免疫活性细胞进入中枢神经系统，从而使免疫介导的脱髓鞘反应得以发生。研究结果表明,神经系统少突胶质细胞、施万细胞的损伤可以通过脑脊液S100b蛋白来反映[3] ，损伤的具体机制主要有以下几个方面：⑴S100b蛋白能够促进少突胶质细胞DNA断裂以及随后合成多聚腺苷二磷酸核糖时的能量消耗;⑵S100b蛋白活性中间产物可以激活金属蛋白酶，某些金属蛋白酶对髓鞘的组分具有降解作用;⑶S100b蛋白的活性中间物可以使脂质过氧化,一方面可以影响膜的流动性和通透性，另一方面可以改变脂质的构象使之易于被巨噬细胞识别和吞噬，最终可导致轴索退化，轴索的损伤将导致神经系统不可逆的损害。本实验中，MS和GBS中S100b蛋白水平升高，正反映了这一点。

　　MBP是髓鞘的主要蛋白质,具有神经组织特异性，可作为反映CNS有无实质性损害,特别是有无髓鞘损伤的特异性生化指标。Barkhof等[4]研究发现，复发型MS患者活动期CSF中MBP与临床评分和MRI显示病灶体积高度相关，说明MBP含量的高低在一定程度上反映了髓鞘损伤的严重程度。本研究结果显示，MS和GBS组患者脑脊液中MBP水平显著高于正常对照，说明脱髓鞘患者神经系统内确实存在髓鞘的破坏。进一步通过对S100b和MBP二者水平的相关分析研究发现，MS组和GBS组患者脑脊液中S100b和MBP的水平均具有相关性，提示S100b的水平与髓鞘脱失的严重程度相关，S100b水平的高低间接反映了疾病的严重程度。

　　本研究证实，炎性脱髓鞘患者CSF IgGOB阳性率显著高于正常对照组，说明该免疫球蛋白是由神经系统内源性合成，IgG由激活和扩增的浆细胞产生，故患者神经系统存在异常体液免疫反应[5]。免疫活性细胞淋巴细胞、浆细胞等和免疫球蛋白IgG是细胞免疫和体液免疫的物质基础，说明炎性脱髓鞘患者既有体液免疫功能异常，也存在细胞免疫功能紊乱。研究表明，脑脊液免疫球蛋白IgGOB的水平与S100b的增生一致，S100b通过抗增生或细胞毒性作用从而导致少突胶质细胞损伤[6]。

　　综上所述，该研究表明，细胞免疫和体液免疫共同参与了炎性脱髓鞘疾病的自身免疫发病机制。其中S100b作为一种毒性因子和免疫调节因子在疾病的发生和发展过程中起到非常重要的作用，受到越来越多的重视。通过对患者CSF中S100b的检测，可以对疾病的诊断、病情的监测、预后的判断及治疗提供重要的帮助。

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　　[4]Barkhof F,Frequin ST,Hommes OR,et al.A correlative triad of gadoliniumDTPA MRI, EDSS,and CSFMBP in relapsing multiple sclerosis patients treated with highdose intravenous methylprednisolone[J].Neurology,1992,42(1):63-67.

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