自体心包外支架预防静脉移植物再狭窄的动物模型的建立

作者:杨红伟,吴若彬,郭惠明

 【关键词】  自体心包；静脉移植物；模型；动物

      [摘  要]   目的: 建立自体心包外支架包裹静脉移植物减轻内膜增生的动物模型，探讨自体心包外支架预防静脉移植物再狭窄的可行性。方法: 以“no-touch”方法取犬一侧颈外静脉，对半剪成两段后分别吻合在双侧股动脉上,其中一侧静脉移植物外包裹自体心包（实验组），另一侧为单纯的静脉移植（对照组）。术后2周、4周分别切取移植静脉,行HE和WEIGERT染色，图像分析系统测量和计算内膜厚度、内膜面积。免疫组化法检测静脉移植物平滑肌细胞增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平。结果: 除1条犬死亡外，余12条成活，所有动静脉吻合口无狭窄。 实验组静脉移植物术后2周、4周内膜厚度、内膜截面积和PCNA指数均明显低于对照组(P<0.01)。结论: 该动物模型设计合理，自体心包可作为静脉外支架的材料，能明显减轻内膜的增生，减少平滑肌细胞的增生。

    [关键词]  自体心包；静脉移植物；模型；动物

     Establishment of Experimental Animal Model for Preventing the Stenosis of Vein Grafts with  Autologous Pericardium External Stent    YANG Hong-wei1, WU Ruo-bin2, GUO Hui-ming2, ZHANG Shao-yi2  (1Department of Cardiovascular Surgery, Shenzhen Second People's Hospital, Shenzhen，Guangdong 518035, China; 2Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Provincial Cardiovascular Institute, Guangzhou, Guangdong 510100, China)

    Abstract：Objective  To establish an experimental animal model for preventing the stenosis of autologous vein grafts with  autologous pericardium external stent. Methods  A piece of  autologous  pericardium which was 7 cm×4 cm was harvested by right anterolateral thoracotomy incision. Two equal segments of jugular vein were transplanted to both sides of femoral arteries in 12 dogs. One side of the vein graft was supported by autologous  pericardium （test group）. The vein grafts were harvested at 2 weeks, 4 weeks after operation. The thickness and area of neointima in the vein grafts was calculated by computer image analysis system. PCNA expression was carried out with immunohistochemistry.  Results  The thickness and area of neointima  in the vein grafts in test group excteded control group significantly ( P< 0.05). The vascular smooth muscle cell proliferation in test group was significantly lower than that in control group (P<0.05).Conclusion The model was developed rationally with a high successful rate. The autologous pericardium external stent can reduce intimal and medial hyperplasia.

    Key words：Vein graft; Autologous pericardium; Model; Animal

  　冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass graft,CABG）后静脉狭窄是影响手术疗效的主要因素。静脉移植于动脉系统之后,由于动脉压力及流体力学的作用,使得静脉移植物(vein graft,VG)发生过度扩张,进而引起其内膜增生,导致管腔狭窄、闭塞[1]。国外一些学者力图通过血管外周支持,改善VG的力学性能,提高其远期通畅率[2]。本研究选用犬自体心包组织作为静脉外支架的材料，建立用自体心包外支架保护静脉的动物模型，观察其对VG的内膜增生的影响，以期为临床治疗提供新的思路。

 1  材料与方法

    1.1   实验动物与分组雄性犬13只。按照完全随机的方法将每只实验犬的左、右股动脉接受实验组和对照组静脉搭桥，每组形成自身对照（配对实验）。其中一只动物于术后10 d，因静脉桥破裂出血死亡，余12只全部成活。

    1.2  动物模型的建立及标本处理犬气管插管全身麻醉，右第4肋间进胸，切取心包7 cm×4 cm大小，仔细止血，张肺后关胸，不放引流管。将心包展平，用7号针头将心包刺成间隔约5 mm多孔状，放入生理盐水中备用。以“no-touch”方法游离右侧颈外静脉长约15 cm，用肝素盐水（5 u/ml）冲洗干净，不用压力扩张静脉，对半剪成两段，作搭桥用；游离犬双侧股动脉，在预吻合口两侧暂时阻断血流（使用阻断带），将两段静脉分别端侧吻合于两侧股动脉上，建立股动脉自体血管转流旁路术；先开放一侧动脉远心端，血液回流使静脉桥自然充盈后再夹闭，将心包纵行包裹于静脉桥之上，用6/0 prolene线连续缝合。吻合完毕后，在两吻合口之间结扎股动脉。动物苏醒后送动物中心饲养，口服阿斯匹林片（50 mg/d）。分别于术后2周、4 周取颈静脉移植物标本，固定于10%甲醛溶液中以备光镜制片。

    1.3    形态学观测 标本作石蜡切片,苏木素伊红(HE) 染色、弹力纤维染色（Weigert法）。全自动图像分析系统（Knotron IBAS 2.5）测量内膜厚度、内膜面积、管腔直径、管腔面积。

    1.4   免疫组织化学检查  取切片行平滑肌增殖细胞核抗原（PCNA）染色，操作方法严格按照说明书进行。结果判定:阳性细胞表现为细胞核中有棕黄色颗粒，PCNA作为平滑肌细胞增殖的标志。

    1.5   统计学处理数据用均数±标准差表示，用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，作配对样本间的student’t 检验；P<0.05为差异具有显著性。

    2  结果

　共有13条实验犬接受外科手术，搭桥26根。其中一条动物在术后10 d，因静脉桥破裂出血死亡。在实验终点取材时，所有的静脉桥都通畅，无血栓、无闭塞。

    2.1   移植静脉的形态学结果对照组静脉移植物的内膜厚度和内膜截面积在术后2周、4周均增加明显，而实验组增加较轻，各项数据测量结果见表1，存在显著性差异(Ｐ<0.05)。

    2.2   PCNA指数   术后2周对照组PCNA阳性细胞增殖强烈，主要分布于VG中膜近管腔侧与内膜，而实验组增殖不明显，对照组PCNA阳性细胞指数明显高于实验组，差异具有显著性(P<0.01)；术后4周，两组PCNA阳性细胞均减少，但对照组PCNA指数与同期实验组比较，仍高于实验组，差异仍有显著性(P<0.05)，见表1。 表1   术后2周、4周静脉移植物的病理测定结果 （略）注：对照组与实验组对比，*P<0.05，**P<0.01

    3  讨论

　静脉移植物狭窄和堵塞是影响CABG远期疗效的主要因素。CABG后静脉移植物突然承受较高动脉压力，血流动力学发生改变，管壁张力明显升高，静脉移植物过度扩张引起内皮及管壁损伤，在众多因素参与下，中膜平滑肌细胞迁移、增殖并产生过量的细胞外基质，引起新生内膜形成及管壁增厚，在此基础上逐渐形成粥样斑块，导致静脉桥血管出现晚期狭窄甚至堵塞。由于动脉流体力学在静脉移植物狭窄、闭塞中起着重要的作用，有学者从改善静脉移植物的力学角度出发，提出通过血管外周支持改善静脉移植物生物力学性能，避免静脉移植物过度扩张所致的损伤和过度增生。研究证实，静脉外周支持能提高静脉内面的切应力，减少静脉的周向形变和周向应力[3-4]，可以减轻血管新生内膜增生、管壁增厚[5]，并防止静脉桥早期粥样硬化的发生[6]，从而能提高静脉桥的远期通畅率。血管外周支持物对静脉移植物的生物学效应与材料的性质和种类有着密切的关系[7]。目前，使用的外支架的材料多是聚丙烯、PTFE等医用编织材料。这些材料在体内不可降解，长期存在于人体内会有慢性炎症反应，局部感染，静脉外膜纤维化等[8]不利影响。近年来，可降解的材料作为血管外支持物的材料也应用于实验[9-10]，这些材料在体内达到外支架的作用后自行降解，但尚有很多不确定性，如最佳半衰期，降解材料对管壁及周围组织的生物效应等问题需要进一步研究。我们建立该动物模型，用于研究自体心包作为外支架的可行性。选用自体心包的原因是其来源较丰富，CABG手术中取材方便，有一定的坚韧度，可作为外支架的材料，能避免上述不良反应。自体静脉移植的模型有很多。本实验采用犬的颈外静脉移植到股动脉的端侧吻合方式观察VG内膜变化，主要是考虑到犬的静脉结构更接近于人的大隐静脉，易解剖，暴露好，便于加套静脉外支架。由于本实验用动物自体心包作为静脉外支架的材料，需开胸切取心包，对动物的心肺功能影响较大，术后不易成活，故选用心肺功能相对较好和体形较大的成年犬作为实验动物，术后易于饲养，也符合冠心病好发于成年人的实际情况。为避免因动物的个体差异造成VG管径差异大的问题，我们尽量选择质量、体格相近的犬，减少误差。在进行静脉分离时采用“no-touch”技术，近管壁结扎侧枝，不剥离外膜，移植前不用高压充盈静脉，减小手术损伤对静脉的影响[5]。取心包时采用右侧前外侧切口，操作完后确切止血，由于不能放置胸腔引流管，故在闭合胸腔前，充分张肺，以防止术后气胸、胸腔积液的发生，影响动物成活。文献报道具有大孔的涤纶支架能够更显著地降低新生内膜增厚[11]，故将心包用针处理成多孔状。吻合时所有桥静脉要保持同样的伸长比，桥静脉不能扭曲。在包裹心包时，可开放远端吻合口，远端血液回流到静脉桥，使桥自然充盈，便于缝合心包。实验中用含罂粟碱、肝素的生理盐水保存桥静脉，防止静脉痉挛。术后给以喂食阿斯匹林片剂抗凝，避免术后早期血栓形成。在预实验中观察到如术后不使用抗凝药物，术后血栓栓塞的发生率高，这是VG术后早期堵塞的主要原因。移植静脉内膜增生和再狭窄的机制复杂。本实验用自体心包缝制管性支架作为血管外周支持后2周、4周，内膜厚度和面积及PCNA均低于对照组，说明内膜增生程度明显低于对照组。有人[12]认为PCNA蛋白表达与内膜增殖有密切联系,可作为平滑肌细胞增殖的标志[13]。初步研究已显示自体心包可作为外支架材料,达到预防静脉桥狭窄的目的。其机制可能是心包外支架在术后能防止移植静脉的过度扩张，保护了内皮层、平滑肌层等静脉壁结构的完整性，抑制了平滑肌细胞的增殖及其向内膜迁移，从而减轻新生内膜增生、管壁增厚。但其长期效果有待进一步研究。

   [参  考  文  献]

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　 (1深圳市第二人民医院心外科，广东 深圳  518035； 2广东省人民医院心血管病研究所心脏外科，广东 广州  510100)