非小细胞肺癌中基质金属蛋白酶10的表达

作者:朱少伟,罗光华,张晓膺作者单位：苏州大学附属第三医院1.心胸外科； 2.综合实验室，江苏 常州 213003

   【摘要】  目的： 探讨非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)中基质金属蛋白酶10(matrix metalloproteinase10,MMP10）的表达及其与临床参数间的关系。方法： 使用RTPCR法及免疫组化法，检测32对NSCLC癌组织及癌旁正常组织中MMP10的表达水平,并分析其与性别、年龄、分期、分级、肿瘤大小、淋巴结转移及病理类型之间的相关性。结果： MMP10 的表达在mRNA水平与蛋白质水平表达有差异： MMP10 mRNA在NSCLC癌组织中的表达要显著低于癌旁正常肺组织（P<0.05），MMP10蛋白在肺癌癌组织中的表达要显著高于癌旁正常肺组织（P<0.01）；在NSCLC癌组织中MMP10 mRNA 的表达与MMP10蛋白的表达呈正相关(r=0.4672, P<0.05),而在癌旁正常肺组织中,两者表达相关性无显著统计学差异(r=-0.003022,P>0.05)。结论： MMP10 mRNA在肺癌癌组织中表达要低于正常组织，MMP10蛋白在肺癌癌组织中表达要高于正常组织。

【关键词】  非小细胞肺癌; 基质金属蛋白酶10; PCR; 免疫组化

　　Expression of MMP10 in nonsmall cell lung cancer

　　ZHU ShaoWei1,  LUO GuangHua2,  ZHANG XiaoYing1, ZHENG Lu2, WEI Jiang2,  ZHU Jiang2　　　　(1.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery,  2.Laboratory of Molecular Medicine, the Third Affiliated Hospital, Suzhou University, Changzhou Jiangsu 213003, China)

　　［Abstract］  Objective: To analyze matrix metalloproteinase10 (MMP10) expression in nonsmall cell lung cancer (NSCLC), evaluate the correlations between MMP10 expression and clinicopathologic parameters. Methods： RTPCR was used to assess MMP10 mRNA expression while immunohistochemistry was used to assess MMP10 protein expression in 32 matched lung tumor tissues and corresponding adjacent normal lung tissues. The correlations between MMP10 mRNA, protein expression and clinical parameters, such as gender, age, stage, tumor size, lymph node metastasis or histological type was analyzed.  Results： There was difference between MMP10 mRNA expression and MMP10 protein expression in NSCLC. MMP10 mRNA level was lower in tumor tissue than that in corresponding normal lung tissue by Realtime RTPCR (P<0.05). MMP10 protein was overexpression in tumor tissue as compared to the corresponding normal lung tissue by immunohistochemistry (P<0.01). MMP10 mRNA expression was positive correlated with MMP10 protein expression in tumor tissue (r=0.4672, P<0.05) but had not correlation in corresponding normal lung tissue (r=-0.003022, P>0.05). Conclusion： MMP10 mRNA levels were significantly decreased, however, MMP10 protein levels were significantly higher, in tumor tissues than in its adjacent normal tissues in NSCLC.

　　［Key words］  NSCLC;  MMP10;  PCR;  immunohistochemistry    　　目前肺癌的发生率和死亡率均较高，肺癌可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC），后者大约占80％。肺癌细胞要生长、扩散、转移就必须能够降解和重构细胞外基质(extracellular matrix, ECM)及基膜，促进血管生成。ECM成分的降解是肺癌细胞侵袭和转移的必要步骤。基质金属蛋白酶(matrix  metalloproteinases, MMPs) 是降解ECM最主要的蛋白酶，由25个成员组成。其中基质金属蛋白酶10（matrix  metalloproteinase10，MMP10）是重要一员。研究表明MMP10在上皮源性肿瘤如胃癌［1］、膀胱移行细胞癌［2］、食管癌［3］、皮肤癌［4］、NSCLC［5］等中过表达，本文旨在使用RTPCR法和免疫组化研究NSCLC中MMP10 mRNA及蛋白的表达及其与性别、年龄、分期、分级、肿瘤大小、淋巴结转移、病理类型之间的关系。由于一些看家基因在肿瘤组织和正常组织中表达不同，因此在本研究中，我们首先选择三种不同的基因：GAPDH,  βactin 和 18S rRNA作为内参照，研究它们mRNA在肿瘤组织及其对应正常组织中的表达，选择合适的内参照用于RTPCR。

　1  材料与方法

　　1.1  材  料苏州大学附属第三医院心胸外科2005年10月至2006年3月间手术切除的32例患者的肺癌癌组织及远离癌组织3～5 cm的正常组织32对，液氮保存。其中，男性24例，女性8例，年龄37～81岁，中位年龄61岁。腺癌16例，鳞癌16例。无淋巴结转移18例，有淋巴结转移14例。Ⅰ期18例，Ⅱ期4例，Ⅲ期10例。

　　1.2  方  法

　　1.2.1  引物及探针的设计和合成  GAPDH， βactin,18S rRNA和 MMP10引物和探针均使用Primer Primier 5.0软件，分别根据基因序列NM_002046, E01095, M10098和 NM_002425设计（均由上海生工生物工程有限公司合成），引物及探针序列(5′-3′)如下：GAPDH正义引物GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC，反义引物CGTTCTCAGCCTTGACGGT，探针FAMTTTGGTCGTATTGGGCGCCTGTAMRA； βactin正义引物GACTTAGTTGCGTTACACCCTTTC，反义引物GCTGTCACCTTCACCGTTCC，探针FAMTGACAAAACCTAACTTGCGCAGAAAACA TAMRA；18S rRNA正义引物CGTTCAGCCACCCGAGATT，反义引物CACGCTGAGCCAGTCAGTGTAG，探针FAMCAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTCCTAMRA；MMP10正义引物TGTACCCACTCTACAACTCATTCACA，反义引物TGA ATGCCATTCACATCATCTTG，探针FAMAGCTCGCCCAGTTCCGCCTTTCTAMRA。

　　1.2.2  RTPCR根据总RNA提取试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)说明书提取组织总RNA, 每一组织均取2 μg总RNA,根据cDNA首链合成试剂盒(立陶宛Fermentas 公司，购自晶美生物技术有限公司)说明书，在定性PCR仪中进行逆转录反应。根据EZ10柱DNA胶回收试剂盒（购于上海生工生物工程有限公司）说明书制备标准品。根据公式：分子数(拷贝/μl)＝浓度(μg/μl)碱基长度(bps)×324.5×2×10-9×6.02×1023计算标准品分子数。所有Realtime PCR 反应在LightCycler荧光定量核酸检测仪上进行,每一个标本均做复管,每次反应都带入标准品。PCR反应体系为：10×缓冲液2.5  μl，25 mmol/L MgCl2 1.5  μl，10 mmol/L 4×dNTPs 0.5 μl，100 μmol/L正义引物0.1 μl，100 μmol/L反义引物0.1 μl，100 μmol/L探针0.1 μl，5 U/μl Taq酶0.25 μl，标本2 μl，PCR级水补足至25 μl。18S rRNA, GAPDH 和 MMP10反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性15 s，60℃退火延伸45 s； βactin反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性5 s，55℃退火延伸45 s，均扩增45个循环。反应结束后直接得到Ct值（指样本的域值循环数）及标本中每一个基因的分子拷贝数。每一标本均计算平均Ct值，数据导入Excel进一步分析。

　　1.2.3  免疫组化  标本用石蜡包埋,切成4 μm的薄片,使用免疫组化法染色。以乳腺癌作为阳性对照（武汉博士德生物工程有限公司提供）,以PBS代替一抗作为阴性对照。根据肺癌阳性癌细胞占肿瘤界限细胞数的百分比进行评分,0:0分；<5%:1分；<50%:2分；≥50%:3分。正常肺组织评分原则同肺癌癌组织。分别由三位经验丰富的病理科医生在不知情的情况下予以评分，结果取平均值分析。

　　1.2.4  统计学分析  采用GraphPad Prism 4.03 统计软件，用配对t检验、秩和检验、Spearman 相关分析法及MannWhitney 检验对数据进行分析,P<0.05为差异有显著性。　　　　2  结  果

　　2.1  GAPDH,βactin和18S rRNA在肺癌癌组织及其对应正常肺组织中的表达 肺癌癌组织及其对应正常肺组织中三种基因mRNA比值T/N分别为：18S rRNA 56.0， βactin 94.8，GAPDH 419.9。其中18S rRNA较GAPDH (P=0.0172)和βactin(P=0.3236)变化要小。　　　　2.2  RTPCR结果32对标本中肺癌癌组织MMP10 mRNA的表达水平为癌旁正常肺组织的4.66%（P<0.05）。MMP10 mRNA表达水平与性别、年龄、分期、分级、肿瘤大小、淋巴结转移、病理类型无关（P＞0.05,表1）。

表1  MMP10 mRNA水平差异　略　　　　2.3  免疫组化结果有3例患者无癌旁正常肺组织，免疫组化显示MMP10主要表达于癌细胞胞质中呈棕黄色细颗粒（图1），MMP10在肺癌癌组织中的表达要显著高于癌旁正常肺组织（免疫组化评分分别为2.47±0.61和1.79±0.96,P=0.0055）；肺癌癌组织中MMP10的表达与性别、分期、分级、肿瘤大小、淋巴结转移或病理类型无关(P>0.05)，与年龄呈正相关（r=0.4262,P=0.0168）,癌旁正常肺组织中MMP10的表达与性别、年龄、分期、分级、肿瘤大小、淋巴结转移或病理类型无关(P>0.05)。

　　2.4  RTPCR 结果与免疫组化结果相关性肺癌癌组织中MMP10 mRNA的表达与MMP10蛋白的表达呈正相关(r=0.4672, P<0.05),而在癌旁正常肺组织中,两者表达无相关性(r=-0.003022,P>0.05).

　　3  讨  论　　　　使用RTPCR研究mRNA表达选择一个合适的内参照很重要，此内参照需要在不同组织中持续表达，而看家基因通常被用作内参照。然而，一些看家基因在肿瘤组织和正常组织中表达不同。有报道认为βactin［6］和GAPDH［7,8］在一些肿瘤中表达有变化，但也有研究表明在使用RTPCR 研究NSCLC时，GAPDH是一个合适的内参［9］。与此同时，有些研究建议在从基因水平研究肺癌时使用18S rRNA作内参照［10］。作为内参照应该在各种不同的细胞类型、不同发育阶段、采用不同处理方法时都能稳定表达。本试验选择了三种常用看家基因，比较了肺癌癌组织及其对应正常肺组织中mRNA水平，结果显示18S rRNA表达最稳定，最适合作为内参照用于NSCLC的研究。因此，本实验选择18S rRNA作为内参照分析MMP10 mRNA在NSCLC中的表达。本研究结果显示MMP10 mRNA在肺癌癌组织中表达要低于正常组织，MMP10蛋白在肺癌癌组织中表达要高于正常组织。免疫组化的结果与以前的研究［5］结果一致。肺癌癌组织及癌旁正常肺组织中MMP10 mRNA和MMP10蛋白表达差异的原因目前还不清楚，可能的原因有以下几点：（1）mRNA的半衰期最短，由几分钟到数小时不等。蛋白质的半衰期相对长，且不易被降解。肺癌癌组织中RNA酶表达上调，使指导MMP10翻译的mRNA降解更快更多。（2）MMP10基因启动子区域可被诱导，表现出调控子惊人的保守性，其基因的表达可以被生长因子、细胞因子及其他环境因素如接触到ECM所诱导［11］。在肝脏星形细胞中锌指蛋白267能与MMP10启动子区域结合，是MMP10表达的负相转录调节物质［12］。而在肺癌中其是否有同样的作用，这还有待于进一步研究。正常肺组织中MMP10mRNA翻译成MMP10蛋白的过程中，可能存在一些致炎因子、细胞因子或其他因素等对其的负反馈调节机制，使得MMP10蛋白的合成不过量，既能满足机体的生理需求，如创伤修复［13］，又不致对机体产生危害。而NSCLC癌组织中则失去了此负反馈调节机制，尽管其MMP10 mRNA表达水平低于癌旁正常肺组织，但是其MMP10蛋白的合成量和MMP10 mRNA呈正相关，从而表现出MMP10蛋白的表达高于癌旁正常肺组织，为NSCLC癌细胞的生长迁移开辟了道路；肺癌癌组织中MMP10蛋白的表达与年龄呈正相关（r=0.4262,P=0.0168）,癌旁正常肺组织中MMP10蛋白的表达与年龄无关，有可能年龄大的NSCLC患者中负反馈机制缺陷。有关详细的调节机制仍有待于进一步研究。（3）蛋白质合成后有三种输送方式：保留在胞质；进入其他细胞器；分泌至体液，输送至该蛋白应起作用的靶器官和靶细胞。MMP10主要由成纤维细胞、正常细胞和转化鳞状上皮细胞产生［14,15 ］， MMP10可能由这些细胞合成后，输送至癌灶,通过与一些物质如层粘连蛋白5,经不同的信号途径进入癌细胞胞质发挥作用。有关MMP10的作用机制仍需进一步研究。综上所述，从基因水平研究NSCLC时，18S rRNA是一个理想的内参照。MMP10 mRNA在肺癌癌组织中表达要低于正常组织，MMP10在肺癌癌组织中表达要高于正常组织。这一基因和蛋白水平上，MMP10矛盾的表达仍有待于进一步研究。(本文图1略）

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