肺缺血预处理在深低温停循环中肺保护的实验

作者：董莉亚   

作者单位：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心心胸外科，上海，200127 【摘要】  目的 评估肺缺血预处理(ischemic preconditioning,IP)在深低温停循环（deep hypothermic circulatory arrest，DHCA）心外科手术中对肺功能的保护作用。方法 幼猪在体DHCA实验模型，分常温再灌注组（基线组）、无肺IP的DHCA组（对照组）和有肺IP的DHCA组（IP组），测体外循环(extracorporeal circulation,ECC)前、结束即刻和结束后1h肺静态顺应性和肺血管阻力值；以左房血和肺动脉血中相关炎性介质浓度和白细胞黏附分子受体表达值的比值（LA/PA），反应肺区释放量和激活量；ECC结束即刻取肺组织行光、电镜观察。结果 三组ECC后，肺静态顺应性均显著降低，肺血管阻力均显著增加，IP组较对照组有显著差异，显示了明显的肺保护作用。三组ECC后，肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-10的LA/PA比值均显著增加，而IL-8比值仅在对照组和IP组明显增加；TNF-α比值IP组较其他两组无显著差异；IL-8、IL-10比值，IP组较对照组均显著降低；中性粒细胞CD18表达比值，仅在对照组ECC后1h相对于ECC前显著降低；单核细胞CD18表达比值，对照组较基线组显著降低。光镜和电镜下的肺损伤程度IP组较对照组明显减轻。结论 本研究示DHCA加剧ECC肺区炎性反应，证实了肺IP可以减轻DHCA情况下缺血再灌注引起的炎性反应性肺损伤，从而保护肺功能。 【关键词】  体外循环 深低温停循环 肺缺血预处理 缺血再灌注损伤    The Experimental Research of Protective Mechanism of    Lung Ischemic Preconditioning in Deep Hypothermic    Circulatory Arrest Extracorporeal Circulation    DONG Li-ya1，ZHENG Jing-hao2，WANG Li-min1，XIAO Ming-di1，ZHU De-ming2    （1. Department of Cardiovascular Surgery，Shanghai First People's Hospital，    Shanghai Jiao Tong University Affiliated First People's Hospital，Shanghai  200080；    2.Department of Pediatric Thoracic and Cardiovascular Surgery,Shanghai Children's Medical Center，    Shanghai Jiao Tong University，School of medicine，Shanghai  200127，China）    Abstract: OBJECTIVE   To evaluate the protective effect of using  lung ischemic preconditioning（IP） prior to cardiac surgery with deep hypothermic circulatory arrest（DHCA） extracorporeal circulation(ECC).METHODS  Using an animal model of DHCA ECC，piglets were divided randomly into three groups：normothermic ECC reperfusion group（baseline group）,DHCA group without lung IP（control group） and DHCA group with lung IP（IP group）.Lung static compliance and pulmonary vascular resistance were measured at the beginning and end of ECC and one hour later. Blood was simultaneously drawn from the left atrium（LA） and the pulmonary artery（PA），the level of TNF-α、IL-8 and IL-10 were determined，as well as the adhesion molecules CD18 on leukocytes. As a measure of the pulmonary release，ratios of LA/PA levels were calculated. A piece of lung tissue was taken at the end of ECC to evaluate morphology by light and electron microscopy. RESULTS  After ECC lung static compliance was significantly decreased whereas pulmonary vascular resistance was significantly increased，IP group showed the significant protective effect. After ECC LA/PA ratios for TNF-α,IL-10 were significantly increased in each groups ，whereas the ratios for IL-8 were significantly increased only in control and IP groups,LA/PA ratios for TNF-α had no significant difference between IP group and the other two groups； LA/PA ratios for IL-8 in IP group were significantly decreased compared with control group,LA/PA ratios for IL-10 both in control group and IP group were significantly increased compared with baseline group，LA/PA ratios for IL-10 in IP group were significantly decreased compared with control group. LA/PA ratios of CD18  on neutrophils only in control group at 1h post-ECC were significantly decreased compared with pre-ECC,LA/PA ratios of CD18  on monocytes in control group were significantly decreased compared with baseline group. Histologic findings showed less lung injury in IP groups than in control groups. CONCLUSION  Our study indicats that DHCA aggravated lung inflammatory response during ECC，lung IP had a protective effect in lung ischemia reperfusion injury during DHCA.

   Key words：  Extracorporeal circulation;Deep hypothermic circulatory arrest;Lung ischemic preconditioning;Ischemia reperfusion injury

    缺血预处理(ischemic preconditioning,IP)对脏器的缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤的保护作用已在骨骼肌、肝脏、肺、肾脏、肠和脑等器官功能保护中得到不同程度证实。我们试图通过动物实验将肺IP应用在体外循环(extracorporeal circulation,ECC)深低温停循环（deep hypothermic circulatory arrest，DHCA）过程肺I/R前，以证实其对肺功能的保护作用。

    1  资料与方法

    1.1  材料和分组  实验种小猪18头，雌雄不拘，年龄3～4周，体重7～10 kg。全组采用FCR-1型一次性贮血滤血器、微栓过滤器、NMY－3500型膜式氧合器和Sarns7400滚压式ECC机。实验过程中使用Servo900呼吸机辅助呼吸。放免法试剂盒由北方生物试剂所提供，采用SN-695A型智能放免γ测量仪。流式细胞分析试剂盒由BD Biosciences pharmingen公司提供，采用美国Beckman Coulter公司Epics XL型号的流式细胞仪，流式细胞分析采用SystemⅡ软件。

    实验动物随机分三组：常温ECC再灌注组（基线组，n=6）、无肺IP的DHCA组（对照组，n=6）和有肺IP的DHCA组（IP组，n=6）。

    1.2  模型的建立  阿托品20 μg/kg，氯胺酮15 mg/kg肌注，硫喷妥钠25 mg/kg和琥珀胆碱0.5 mg/kg耳缘静脉推注麻醉，气管插管，设呼吸机通气模式为控制性机械通气（CMV），监测直肠温。股动脉置管监测动脉压并备抽血样做血气分析，股静脉建立静脉通道和维持麻醉通路。胸骨正中切开显露心脏，右室流出道和左心耳置测压管连续监测肺动脉（pulmonary artery ，PA）压、左房（left atrium ，LA）压及采血标本。电磁血流仪探头置于肺动脉干上监测心输出量。

    肝素化后，常规升主动脉、右心耳插管建立ECC。与常规ECC管道连接不同的是IP组主动脉泵管接“Y”型分流管经另一灌注泵与肺动脉的灌注插管相连。三组ECC开始3 min内，均常温（35℃～37℃）ECC流量渐增至100～150 ml/（kg·min）后停止机械通气。此后基线组以100～150 ml/（kg·min）继续常温ECC，30 min后重新开始机械通气，60 min后停ECC，继续机械通气60 min。对照组以100～150 ml/（kg·min）ECC，30 min左右降温至肛温18℃～20℃后,阻断主动脉并注入冷晶体心肌保护液（15 ml/kg），停止ECC，DHCA开始。60 min后恢复ECC并开放主动脉，恢复机械通气，以90～120ml/（kg·min）的流量转流升温大约30 min至肛温35℃，继续维持并行循环30 min，停ECC。IP组以100～150 ml/（kg·min）流量转流5 min后，开启灌注泵，将分流管的血液以25 ml/（kg·min）的流量注入肺动脉,通过左房置引流管使肺循环血液回流至储血瓶。如此以含氧血肺动脉灌注10 min后，停灌注5 min，然后再灌注10 min。如此肺IP两次后阻断主动脉，开始DHCA，余处理同对照组。

    围术期平均体动脉压维持在40～50 mmHg之间，每隔30 min抽血气，DHCA期间实行α稳态管理，ECC结束后1 h内调整呼吸参数维持PaCO2 35～45mmHg之间，PaO2 80～150mmHg之间。

    1.3  观察指标  ECC前、结束即刻、结束后1 h 3个时点测吸气停顿压(Ppause)、潮气量(TV),计算肺静态顺应性(Cstat=TV/Ppause)（单位：ml/cmH2O）。同时测平均肺动脉压、左房压、心输出量，计算肺血管阻力指数（(平均肺动脉压力-左房压)×体重/心输出量）（单位：mmHg/（kg·min·ml）。

    1.4  标本留取及检测

    1.4.1  各时点从肺动脉干和左房测压管上抽血，用放免法检测血液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-8、IL-10水平，将测量值按照血色素水平10g/dl进行校正（校正值＝测量值×10／测定血红蛋白值），计算LA/PA值。

  1.4.2  各时点左房和肺动脉血中β2整合素亚单位CD18在中性粒细胞和单核细胞上的表达值(%)为小鼠抗猪CD18-PE标记单抗及对照品小鼠的IgG1-PE标记抗体在流式细胞仪上测定的表达值之差，计算LA/PA值。

    1.4.3  ECC结束即刻取左下肺小块组织二块分别用4%福尔马林和戊二醛固定,在光、电镜下进行肺组织超微结构观察。

    1.5  统计学方法  数据分析用SPSS11.5,计量数据以均数±标准差(±s )表示。组内各时间点两两比较用Dunnett's检验(ECC前作为控制时间点)。组间差异用单因素ANOVA方差分析并用LSD's方法进行组间两两比较。P<0.05为差异有显著。

    2  结  果

    三组动物在体重、性别比、实验前用药、麻醉用药及体外循环用药方面无统计学差异。各观察指标在体外循环开始前组间差异无显著性（P＞0.05）。

    2.1  呼吸功能指标测量  ECC后肺静态顺应性显著降低，肺血管阻力显著增加，三组间有显著性差异（P<0.05）。IP组显示明显的肺功能保护作用。见表1。

    2.2  炎性介质水平  ①组内对照比较：除IL-8比值在基线组内无显著差异，余各组内对照均差异显著（P<0.05）。②组间对照比较：IL-8比值IP组与对照组相比显著降低（P<0.05）；IL-10比值对照组和IP组与基线组相比显著升高（P<0.05）。见表2。

    2.3  白细胞黏附分子受体的表达值  ①组内对照比较：CD18在中性粒细胞上的表达值比值，仅在对照组ECC后1h自身对照显著降低（P<0.05）；②组间对照比较： CD18在单核细胞上的表达值比值，仅对照组与基线组比较显著降低（P<0.05）。见表3。

    2.3   光镜和电镜结果  实验中肉眼观察到肺水肿程度基线组最轻，对照组最重。

    光镜下可见对照组肺组织表现为肺泡壁增厚,肺间质水肿,多形核白细胞（polymorphonuclear leukocyte, PMN）浸润,毛细血管内微血栓形成,肺组织渗出增加（图1）。而IP组肺组织改变明显减轻（图2）。基线组肺组织改变不明显（图3）。

    电镜下可见对照组肺泡壁毛细血管变性坏死，未见完整毛细血管壁，管腔内见较多红细胞和变性的炎细胞（图4）。IP组见肺泡腔内数个炎症细胞，数个Ⅱ型细胞，板层小体密度降低（图5）。基线组毛细血管内皮细胞核肺泡壁上皮细胞基本正常（图6）。表1  各组呼吸功能指标比较注：★与基线组比较，P＜0.05；▲与ECC前比较，P＜0.05；#与对照组比较，P＜0.05表2   各组LA和PA中炎性介质比值比较 注：★与基线组比较，P＜0.05；▲与ECC前比较，P＜0.05；#与对照组比较，P＜0.05表3  各组LA和PA中白细胞上CD18表达值比较 注：★与基线组比较，P＜0.05；▲与ECC前比较，P＜0.05

    3  讨  论

    随着手术适应证的提高，尤其是低龄复杂型先心病DHCA术后呼吸衰竭的发生率有上升趋势，解决危重低龄患儿DHCA术后肺损伤已成为提高手术疗效、降低总体死亡率的最有效途径。为了减少ECC中的炎性反应，新的肺保护方法层出不穷，各有利弊［1-3］，但DHCA牵涉到降温、停循环、升温和再灌注几个阶段，目前对于未成熟肺还没有一个较完善和成熟的肺保护方法。

    3.1   IP在肺的缺血再灌注损伤中的应用  鉴于在缺血性心、脑血管病的防治及心、肝等器官移植方面IP的实验研究，国外已有学者在肺缺血再灌注损伤领域里提出肺IP的理念。如Gasparri RI等［4］了解到供肺保存前短暂缺血多次比单次更能减轻肺水肿，并改善氧合能力。而Featherstone RL等［5］进一步在动物实验中证实肺缺血再灌注前用肺保护液灌注的IP二次处理明显优于单次，而且在用含血肺保护液灌注肺同时给予通气的预处理，即通气和肺血灌注的IP比单一的肺通气或单一的肺灌注的IP更能保护肺组织,避免肺缺血再灌注损伤效果更佳。Li GH等在犬肺移植的缺血再灌注模型中［6］和在体鼠肺缺血再灌注损伤模型中［7］都证实肺IP能够减弱肺再灌注损伤，而且中性粒细胞活性的抑制是一个主要的保护效应。

 3.2   IP在DHCA中的应用  DHCA时肺组织的病理生理过程类同于脏器的缺血低温保存，所以尝试将DHCA中肺保护研究方向从"外源性因素"转移到内源性组织细胞保护方面。我们采用了幼猪在体体外循环DHCA实验模型,检测围术期肺区炎性反应和呼吸功能。临床上前并行阶段ECC开始直到全流量转流后才停机械通气，所以，本实验ECC开始3 min 内要求流量逐渐增至全流量（以消除组间误差），3 min 后停止机械通气，继续前并行30 min ，IP措施在ECC 30 min 前并行阶段实施。根据文献记载［8］,实验中取左房血和肺动脉血，测其中炎性介质浓度和白细胞黏附分子受体表达值，计算LA/PA值可完全反应相应肺区炎性因子的释放量及肺组织中激活的白细胞潴留程度。

    3.3   IP应用在DHCA中可能的肺保护机制  ECC的肺损伤是一种肺内过度性、失控性的炎性反应，该过程中转录因子、细胞因子、趋化因子和粘附分子等发挥了关键作用。本研究中，三组ECC后两时点较ECC前肺区TNF-α生成量均显著增加，而IL-8仅在对照组和IP组明显增加。表明ECC后肺组织炎症因子和抗炎性反应都增强，IL-8在基线组没有显著改变可能与其炎性反应时间较短，浓度不足以测出有关。ECC期间抗炎性细胞因子的释放通过抑制促炎细胞因子的生成起保护作用［9］，这些促炎反应和抗炎反应的平衡可影响炎性反应的发展。本研究中，ECC后两时点，对照组相对于基线组肺源性TNF-α、IL-8显著增加，而IP组相对于基线组肺源性TNF-α、IL-8没有显著变化。同时，IP组相对于对照组肺源性IL-8显著减少。IL-10被认为是细胞因子合成抑制因子，是一个潜在的抗炎因子，它能减少中性粒细胞黏附在激活的内皮细胞上，而且是IL-8最有效的抑制剂［10］。本研究中肺区IL-10产生量，对照组相对于基线组、IP组相对于基线组均显著增加，而且IP组和对照组比较显著减少。可见IP取消了TNF-α和IL-8的反应，扩大了IL-10的反应，从而将循环中细胞因子平衡向抗炎方向转移。各组ECC后促炎和抗炎反应两者的平衡间，对照组向促进炎性反应方向发展，而在IP组则倾向于向抗炎性反应方向发展。

    缺血再灌注组织损伤的病理表现也能证实炎性反应，包括促炎细胞因子的产生、单核细胞和多型核白细胞的激活以及组织侵犯。CD18在单核细胞和中性粒细胞上都有中等程度的表达，可以反应这两种细胞激活的数目。伴ECC的心脏手术后黏附分子LFA-1（CD11a/CD18）和Mac-1（CD11b/CD18）的表达增加被认为与术后肺损伤的程度有关［11］。我们研究发现IP组ECC后中性粒细胞潴留虽相对于基线组显著增加，但是IP组和对照组之间的显著差别性说明IP不能对DHCA情况下的冷缺血再灌注引起的中性粒细胞激活起保护作用，可能是由于两个原因：一是由于中性粒细胞对缺血再灌注损伤的延迟反应［12］，二是由于相对于ECC前，IP组肺内的单核细胞潴留率显著增多。从而使炎性反应失控有关。而在对照组，不但激活的中性粒细胞肺潴留增加，而且激活的单核细胞潴留也增加，所以肺源性TNF-α和IL-8产生最多，与DHCA组术后肺功能受损最严重相一致。

    将肺IP应用在DHCA过程肺的缺血再灌注前，结果发现三组ECC后肺静态顺应性均显著降低，肺血管阻力均显著增加，组间比较IP组和对照组有显著差异，提示IP组肺功能明显改善。其原理可能在于肺IP减轻DHCA情况下缺血再灌注引起的炎性反应性肺损伤，从而保护肺功能。

【参考文献】  ［1］ Suzuki T, Ito T, Kashima I,et al. Continuous perfusion of pulmonary arteries during total cardiopulmonary bypass favorably affects levels of circulating adhesion molecules and lung function［J］. J Thorac Cardiovasc Surg, 2001,122(2):242-248.

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