蛋白激酶C在心肌缺血预处理中的作用机制研究

作者：何斌,王志农,王军,徐志云作者单位：第二军医大学长海医院胸心外科，解放军胸心外科研究所，上海 200433

   【摘要】  目的 观察猫心肺转流（Cardiopulmonary bypass，CPB）中应用蛋白激酶C（PKC）抑制剂-多粘菌素B（Poly B）及PKC激动剂-佛波酯（PMA）对缺血再灌注（IR）心肌组织中PKC激活程度的影响及其与心肌组织内Ca2＋含量变化的关系，评价PKC在缺血预处理（IPC）机制中的作用。方法 将120只健康家猫随机分为对照组、IR组、IPC组、Poly B组和PMA组；建立CPB模型。应用底物蛋白磷酸化法和原子吸收光谱法，分别测定CPB中主动脉阻断（ACC）及再灌注期间心肌组织中胞膜和胞浆中PKC活性以及心肌组织中Ca2＋含量的变化。结果 IR组ACC 60 min后心肌组织胞膜和胞浆中PKC活性均明显降低（P<0.01），并于再灌注期间进一步下降，同时伴有心肌组织中Ca2＋含量迅速升高；ACC后各时间点PKC活性均较对照组明显降低（P<0.01）；IPC组于ACC及再灌注后胞浆PKC活性较CPB前显著下降（P<0.01），但胞膜PKC活性却显著升高（P<0.01），而且均明显高于IR组（P<0.01）；其心肌组织Ca2＋含量在ACC 60 min以及再灌注期间虽较对照组有所升高（P<0.05），但明显低于IR组（P<0.01）；Poly B组心肌组织胞膜和胞浆中PKC活性的变化趋势与IR组相似，再灌注期间其Ca2＋含量虽较IPC组有升高趋势，但仍明显低于IR组（P<0.05）；PMA组PKC活性以及Ca2＋含量变化趋势与IPC组相近。结论 PKC的激活参与介导了猫IPC的心肌保护作用；PKC抑制剂Poly B不能完全阻断IPC的效应，而PKC激动剂PMA可部分模拟IPC的作用。

【关键词】  缺血预处理；蛋白激酶C；缺血再灌注损伤；心肺转流

　　Role of Protein kinase C in the Protection of Ischemic Preconditioning on the Myocardial Ischemia and Repurfusion Injury in Cat Heart

　　HE Bin, WANG Zhi-nong, WANG Jun, XU Zhi-yun, HUANG Sheng-dong, ZENG Zhi-yong, ZHANG Bo, ZHANG Bao-ren

　　Department of Cardiothoracic Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, PLA Institute of Cardiothoracic Surgery, Shanghai 200433, China

　　Abstract: OBJECTIVE   To investigate the role of protein kinase C (PKC) in mediation of ischemic preconditioning (IPC) against myocardial reperfusion injury by using PKC inhibitor polymyxin B (Poly B) and PKC activator 4β-phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) during cardiopulmonary bypass (CPB) in feline. METHODS  One hundred and twenty felines were randomized into five groups: control group (n＝24), in which CPB was conducted without aortic cross-clamping (ACC); IR group (n＝24), with 60 min cardiac arrest by ACC followed by 30 min reperfusion, and cardioplegia used during the period of ACC ; IPC group (n＝24), with protocol similar to that of IR group except for three-round 15 min IPC applied before ACC; Poly B group (n＝24), with protocol similar to that of IPC group except for polymyxin B administered after starting of IPC; PMA group (n＝24), with protocol similar to that of IR group except for PMA administered before ACC. Membrane and cytosol fraction of PKC activity was assessed by biochemical assays, and myocardial Ca2＋content was determined simultaneously. RESULTS   PKC activity in both membrane and cytosol fractions was significantly reduced after 60 min cardiac arrest with ACC and during myocardial reperfusion in IR group while the Ca2＋content in myocardium was significant increased. However, IPC enhanced the activation and translocation of PKC to the membrane and significantly reduced the rise in myocardial Ca2＋content. Although membrane and cytosol fraction of PKC activity were also both inhibited by Poly B after ACC, the increase of myocardial Ca2＋content was markedly attenuated which was comparable with that in IPC group, whereas the change patterns of PKC activities and myocardial Ca2＋content were similar to IPC in PMA group. CONCLUSION  Cardioprotection by IPC is mediated through enhanced translocation of PKC to the membrane. PKC inhibitor Poly B cannot completely abolish IPC-induced cardioprotection. PKC activator PMA mimics at least partially the protective effect of IPC against myocardial calcium overload.

　Key words：Ischemic preconditioning; Protein kinase C;Ischemia and reperfusion injury; Cardiopulmonary bypass

　　1  材料和方法

    缺血预处理（IPC）可以抑制或减轻心肺转流（Cardiopulmonary bypass，CPB）中心脏停搏引起的心肌缺血再灌注（IR）损伤，但其确切作用机制尚不完全明了。目前已知多种物质如腺苷、缓激肽、肾上腺素以及阿片肽等参与IPC的触发过程［1］。近年来研究发现［1-2］，蛋白激酶C (PKC)可能在IPC效应中扮演着重要角色，但对于其在细胞内信号途径中的具体作用还存在争议。应用PKC抑制剂能否完全阻断IPC对心肌的保护作用也尚无定论。本研究观察猫CPB中应用PKC抑制剂--多粘菌素B（Poly B）以及PKC激动剂--佛波酯（PMA），对猫CPB中缺血再灌注心肌组织中PKC激活程度的影响及其与心肌组织内Ca2＋含量变化的关系，进一步评价PKC在IPC机制中的作用。

　　1.1  动物分组和主要试剂

　　健康猫120只(由第二军医大学动物中心提供)，雌雄不拘，体重（3.2±0.4）kg，随机均分为5组。对照组：仅作单纯的并行CPB； IR组：于CPB开始45 min后分别阻断上、下腔静脉，主动脉阻断（ACC）后经主动脉根部灌注冷晶体停搏液使心脏停搏，ACC期间采用间断顺灌心肌停搏液行心肌保护，ACC 60 min后开放主动脉，心脏恢复再灌注30 min；IPC组：在ACC前先进行IPC（ACC 5 min，再灌注10 min并重复3次），余处理与IR组相同；Poly B组：于IPC开始时在CPB储血槽中加入PKC抑制剂Poly B（2 mg/kg），余处理同IPC组；PMA组：于ACC前在CPB储血槽中加入PKC的激动剂PMA（5μg/kg），余处理同IR组。PMA、组蛋白（Ⅲ-S型）购自Sigma公司，Poly B由本校附属长征医院皮肤科实验室惠赠，［γ-32P］ATP购自北京福瑞生物医学工程公司。  　　1.2  CPB模型的建立及标本的采集 

　　参照文献方法建立CPB模型［3］。各实验组分别于CPB前、ACC 60 min以及再灌注15 min、30 min时取猫心左心室心尖部肌肉，对照组则在相对应时间点取材。

　　1.3  心肌PKC活性测定

　　采用Inoguchi方法稍加改进纯化和制备PKC［4］：将心肌组织标本于液氮中研碎后悬于缓冲液A(20 mM Tris、2 mM EDTA、0.5 mM EGTA、2 mM dithiothreitol、1 mg/ml亮肽素、0.1 mg/ml抑肽酶、1mM PMSF、320 mmol/L蔗糖; pH=7.4)，经Polytron匀浆器匀浆后离心（1 000 g×10 min），取上清离心（100 000 g×60 min，4℃），所得上清液为胞浆PKC部分粗提液；沉积部分加入含1％ Triton X-100的缓冲液A离心（100 000 g×60 min，4℃），取上清为细胞膜PKC粗提液；两种粗提液分别加入预先经缓冲液B (25 mmol/L Tris、2 mmol/L EDTA和50 mmol/L巯基乙醇) 平衡后的DEAE－纤维素柱，经缓冲液B淋洗后，收集洗脱液加入甘油至终浓度为30%。采用底物蛋白磷酸化法测定PKC活性：以组蛋白(III-S型)为底物，通过测定磷由［γ-32P］ATP中掺入组蛋白的放射性强度计算PKC活性。反应液总体积为250 μl，内含Tris 25 mmol/L (pH=7.4)、MgCl2 10 mmol/L、CaCl2 0.5 mmol/L、组蛋白（Ⅲ-S）1 mg/ml、ATP 100 μmol/L (含［γ-32P］ATP 4×106 cpm/ml)、磷脂酰丝氨酸60μg/ml、甘油二油酸酯4μg/ml及适量酶蛋白。反应自加入ATP开始，各管加入1 mg牛血清白蛋白作为载体蛋白；混合液离心（3 000g×10 min，4℃），所得沉淀溶于1 mmol/L的NaOH 0.5 ml中，与甲苯闪烁液混合后，应用Beckman LS-960型液闪计数仪测量放射强度。酶活性以每毫克蛋白每分钟向底物转运磷的摩尔数表示。蛋白浓度用Bradford法测定［5］。

　　1.4  心肌组织Ca2＋含量测定  

　　采用原子吸收光谱法测定［6］。

　　1.5  统计学处理  

　　所有数据均以±s 表示，数据比较采用F分析，并应用SPSS 11.0统计软件包进行统计学处理, P <0.05为差异显著，P <0.01为差异非常显著。

　2  结  果

　　2.1  心肌组织中PKC活性变化

　　CPB前各组间猫心肌组织胞膜和胞浆中PKC活性均无显著差异；对照组随着CPB时间的延长，胞膜和胞浆中PKC活性均呈逐渐缓慢升高趋势，但无统计学意义；IR组ACC 60 min心肌组织胞膜和胞浆中PKC活性均明显降低，分别是CPB前的33.1%和46.4%；再灌注期间胞膜和胞浆中PKC活性进一步下降，至再灌注30 min 仍未恢复CPB前水平，各时间点IR组心肌组织胞膜和胞浆中PKC活性与对照组相比均明显降低；IPC组于ACC 60 min心肌组织胞浆中PKC活性较CPB前显著下降，但胞膜中PKC活性却显著升高；再灌注期间心肌组织胞膜中PKC活性进一步升高，而且在ACC后各时间点心肌组织胞膜PKC活性均明显高于IR组；Poly B组心肌组织胞膜和胞浆中PKC活性的变化趋势与IR组相似，均明显低于IPC组；再灌注期间其胞膜和胞浆中PKC活性无进一步降低；PMA组心肌组织胞膜和胞浆中PKC活性的变化趋势与IPC组相近，但再灌注期间胞膜PKC活性未见进一步升高；在ACC后各时间点其胞膜PKC活性均高于IR组，见表1。表1  猫心缺血再灌注期间心肌胞膜和胞浆中PKC活性的变化（略）注：与主动脉阻断前相比*P<0.05，**P<0.01; 与对照组相比△P<0.05，△△P<0.01; 与IR组相比▲P<0.05，▲▲P<0.01。

　　2.2  心肌组织Ca2＋含量变化

　　CPB前各组心肌组织中Ca2＋含量均无明显差异；对照组Ca2＋在ACC 60 min以及再灌注期间Ca2＋含量较CPB前有上升趋势，但无统计学意义；IR组在心脏再灌注期间，心肌组织中Ca2＋含量迅速升高，其中以再灌注30 min升高幅度最大；IPC组心肌组织Ca2＋含量在ACC 60 min以及再灌注期间虽较对照组有所升高，但升高幅度明显低于IR组；Poly B组再灌注期间Ca2＋含量虽较IPC组有升高趋势，但仍明显低于IR组；PMA组Ca2＋含量变化趋势与IPC组近似，均明显低于IR组，见表2。表2   猫心缺血再灌注期间心肌组织中Ca2＋含量的变化（略）注：与主动脉阻断前相比*P<0.05，**P<0.01; 与对照组相比△P<0.05，△△P<0.01; 与IR组相比▲P<0.05，▲▲P<0.01。

　　3  讨  论

    大量的研究表明，细胞内钙超载和氧自由基的大量产生是导致心肌缺血再灌注损伤的重要因素。CPB中阻断主动脉所致的心肌缺血、缺氧，可引起心肌细胞内钠离子浓度升高，进而通过钠/钙交换主动脉阻断前即体外循环45 min；主动脉阻断60 min即体外循环105 min；再灌注15 min即体外循环120 min；再灌注30 min 即体外循环135 min主动脉阻断前即体外循环45 min；主动脉阻断60 min即体外循环105 min；再灌注15 min即体外循环120 min；再灌注30 min即体外循环135 min （Na＋/Ca2＋exchange），造成的细胞内Ca2＋浓度升高，导致细胞损伤。因此细胞内钙超载被认为是细胞损伤的重要标志［7］。在本研究中，IR组主动脉阻断60 min所致的缺血、缺氧，使心肌细胞胞膜和胞浆中PKC活性降低的同时，心肌组织中Ca2＋含量明显升高，而再灌注期间这种变化更为明显，PKC活性进一步降低，心肌组织中Ca2＋含量较ACC过程中进一步增加；IPC组在ACC和再灌注期间各时间点心肌胞膜PKC活性均明显高于IR组，而且其心肌组织中Ca2＋含量亦较IR组明显降低。提示CPB中主动脉阻断60 min可引起心肌细胞的损伤，IPC可通过激活PKC，降低心肌组织内Ca2＋浓度，有助于减轻CPB缺血再灌注过程中的心肌细胞内钙超载，能够为缺血再灌注心肌提供一定的保护作用。   　　IPC是一种有效的内源性保护机制，其效应的发挥涉及到触发因子产生、细胞内信号传导以及终效应器作用等多个层面。近来的研究显示［1-2］，PKC可能是IPC细胞内信号传导过程的中心环节，但其确切的作用目前仍未完全明了；而且PKC在IPC中的作用可能还存在着种属的差异［8］。一般认为PKC是一类依赖于二酰基甘油或磷脂酰丝氨酸以及Ca2＋刺激而激活，能催化蛋白质内丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化的蛋白激酶。短暂的心肌缺血可以促使某些内源性物质包括腺苷、儿茶酚胺、缓激肽、氧自由基、血管紧张素等的释放，它们可作用于心肌细胞膜上的特异性受体，通过G蛋白的介导，激活磷脂酶C或/和D，使磷酸磷脂酰肌醇二磷酸或肌醇磷脂胆碱水解，引起二酰基甘油生成及细胞内Ca2＋浓度增高，从而激活PKC［2］。目前的研究证实，PKC 家族包括10余种异构体，其中PKC-ε、PKC-δ以及PKC-η主要参与了IPC对心肌的保护作用。本组结果发现，IPC组猫在ACC 60 min后其心肌细胞膜上PKC的活性明显升高，同时胞浆中PKC的活性降低，提示IPC可激活PKC，使得猫心肌细胞浆中PKC向胞膜上移位。在IPC时应用PKC的非特异性抑制剂Poly B，在心肌缺血60 min 后，胞膜和胞浆中的PKC活性均受到明显抑制，而在ACC前应用PKC的激动剂PMA，CPB中尽管没有实施IPC，其胞膜和胞浆中的PKC活性的变化趋势以及心肌组织中Ca2＋含量，却与IPC组相似。表明PKC的激活介导了IPC的心肌保护作用，在实验动物猫IPC 对心肌的保护作用中，PKC也扮演着重要角色，而且PKC激动剂PMA至少可部分模拟IPC的作用。PKC激活后产生的心肌保护作用实际上可能是某些效应蛋白磷酸化的结果。作者认为其机理可能在于：IPC可使胞浆内PKC移位并活化，可直接或间接地作用于ATP依赖的钾离子通道，促进K＋外流，抑制Ca2＋内流［9,10］，减轻钙超载；同时减少ATP消耗，使细胞膜的结构和功能得到保护，从而抑制或减少心肌细胞IR损伤的发生［11］。

  与IR组不同的是，PKC抑制剂Poly B虽然也降低了心肌细胞胞膜和胞浆中PKC的活性，但Poly B组于再灌注期间心肌组织中的Ca2＋含量明显降低，提示抑制PKC并不能完全阻断或抵消IPC的效应，在IPC诱发的心肌保护机制中，PKC可能并不是唯一的细胞内信号传导通道。Maulik等认为除PKC外，酪氨酸激酶（TK）--磷脂酶D系统在IPC作用机理中也发挥着重要作用，而且可能是平行于PKC的另一条细胞内信号传导通道［12］。有研究表明，只有同时抑制PKC和TK才能有效地去除IPC效应［13］。根据本实验推测Poly B虽然抑制了IPC对PKC的激活作用，但并不能阻断其他的、PKC非依赖性的细胞内信号通道，因此只能部分地阻断IPC的心肌保护效应。有关PKC和TK在IPC效应中的作用及相互关系，尚有待进一步深入研究。

基金项目： 上海市曙光计划资助项目(02SG30)；上海市青年科技启明星计划资助项目(00QB14053)

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