蛋白酶体抑制剂对中脑脑片的毒性作用及其机制研究

　　作者：胡锦全,王涛,张麟伟 作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科, 湖北 武汉 430030

　　【摘要】目的：观察蛋白酶体抑制剂对体外培养的大鼠中脑脑片黑质多巴胺(DA)能神经元的早期毒性作用，利用这种新型的组织模型探讨蛋白酶体功能异常在帕金森(PD)发病中的作用。方法：制备Wistar大鼠体外中脑黑质脑片的长期培养体系，加入蛋白酶体抑制剂lactacystin(0.1，0.5，1.0，5.0 μmol/L)作用24 h后，测定培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活力水平观察脑片活力。TH免疫组化观察黑质细胞变性缺失，αsynuclein免疫组化观察αsynuclein的表达，TUNEL法检测多巴胺能神经元凋亡。结果：经0.1,0.5,1.0和5.0 μmol/L浓度的lactacystin作用24 h后，脑片黑质部位TH阳性神经元数量减少，αsynuclein表达率增加，凋亡检测显示,5.0 μmol/L的 lactacystin组部分黑质细胞出现TUNEL染色阳性。结论：蛋白酶体抑制剂lactacystin对脑片中DA能神经元具有毒性作用，能诱导黑质细胞凋亡，其作用具有浓度依赖性。蛋白酶体功能缺陷在帕金森病发病机制中可能发挥重要作用。

　　【关键词】 蛋白酶抑制药 中脑 神经元 多巴胺 帕金森病 大鼠

　　The toxic effects of proteasomal inhibitor on slices of midbrain of rat

　　HU Jinquan, WANG Tao, ZHANG Lingwei

　　(Department of Neurology， Union Hospital Affiliated to Tonji Medical College， Huazhong Science and Technology University Wuhan 430030， China)

　　[ABSTRACT] Objective: To observe the early neurotoxicity of proteasomal inhibitor on dopaminergic neurons in cultured slices of the midbrain and to explore the role of proteasome dysfunction in the pathogenesis of Parkinson's disease.Methods: A longterm midbrain slice culture system of Wistar rats was established, after proteasomal inhibitor, lactacystin(0.1 μmol/L,0.5 μmol/L,1.0 μmol/L,5.0 μmol/L)was added into the culture system for 24h, the vitality of the slices were identified by measurement of lactate dehydrogenase (LDH) released into the medium from the slices. The loss and degeneration of nigral neurons were investigated by tyrosine hydroxylase immunohistochemistry, αsynuclein expression was observed by αsynuclein immunohistochemistry. The apoptosis of dopaminergic neurons was examined by TUNEL stain. Results: After cultured with proteasomal inhibitor lactacystin(0.1 μmol/L,0.5 μmol/L,1.0 μmol/L and 5.0 μmol/L)for 24 hours, the numbers of tyrosine hydroxylase positive cells in substantia nigra decreased and the expression of α-synuclein increased. The measurement of apoptosis showed that some nigra neurons revealed positive TUNEL staining in 5.0 μmol/L lactacystin group. Conclusion： Proteasomal inhibitor lactacystin has toxic effect to dopaminergic neurons on midbrain slices and may induce apoptosis of nigral neurons, which has close relationship with the concentration of lactacystin. Proteasome dysfunction may play an important role in the pathogenesis of Parkinsons disease.

　　[KEY WORDS] Proteinase inhibiting drug; Mesencephalon; Parkinsons disease; Neuron; Dopamine; Rat

　　帕金森病(parkinsons disease， PD)是最常见的神经退行性疾病之一，其病因和发病机制尚未完全明确，主要的病理改变集中在患者中脑黑质致密部位的DA能神经元变性和缺失。不断的研究表明，中脑黑质部位(SNc)DA能神经元选择性死亡与多个基因的突变及众多内、外环境因素的共同作用有关，其中Lewy body中的主要成分αsynuclein蛋白的异常聚集越来越受到重视[1]。泛素蛋白酶体系统(UPS)是真核细胞内重要的蛋白降解通路，功能涉及到细胞周期的调节、细胞凋亡，抗原呈递和免疫应答等多个方面。McNaught 等研究证实，PD患者黑质内蛋白酶体的活力明显下降[2];最近的研究认为，蛋白酶体系统介导的蛋白水解作用不足,会削弱黑质细胞对αsynuclein及其他蛋白的正常降解。这些研究都提示，蛋白酶体功能缺陷可能在PD黑质多巴胺能神经元的变性死亡中发挥重要作用。本实验采用界面法对大鼠中脑脑片进行长时程体外培养，观察其在不同浓度蛋白酶体抑制剂处理后DA能神经元形态及机能的改变;并观察其αsynuclein蛋白表达情况，观察蛋白酶体抑制剂能否诱导多巴胺能细胞发生凋亡，并初步探讨其可能的作用机制。以便为PD的治疗提供新的思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂与仪器

　　Iactacystin购自武汉晶美生物工程公司(美国Alex公司产品);DMEM/F12培养基和马血清为GIBICO产品;小鼠抗大鼠酪氨酸羟化酶(TH)多克隆抗体和兔抗αsynuclein抗体为CHEMICON产品;TUNEL凋亡检测试剂盒和ABC试剂盒购自武汉博士德生物工程公司;LDH检测试剂盒购自南京建成生物工程公司;活组织脑片切片机(McIlwain Tissue Chopper，英国);MillicellCM 微孔膜(0.4 μm)插件购自武汉生命公司(美国Millipore公司产品)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 脑片培养

　　脑片取材于出生8～15 d的Wistar大鼠(购自华中科技大学同济医学院实验动物中心)。操作步骤参考Stoppini[3]的方法，并参考Testa[4]的方法进行改进。将Wistar大鼠酒精洗净后直接断头处死，在无菌条件下冰上操作分离全脑，迅速浸入配制的、预冷的Chopping buffer液中，随后转至消毒好的组织切片机上，按冠状切面切成300 μm厚的连续脑片，选取以正中隆起为中心的连续6片切片放入配制的、预冷的Discetiong buffer液中漂洗，在解剖显微镜下选取中脑水平的脑片3～4片，放入6孔培养板中的微孔膜插件上，每个膜上放3～4片脑片，加入约1 mL的脑片培养基(DMEM/F12中加入10%热灭活马血清，100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL链霉素)，使培养液面刚好到达脑片平面但不浸入。在34 ℃、100%湿度、5%二氧化碳的培养箱中培养。培养第1天后更换培养液1次，以后每2 d更换1次培养液，第1天后在培养液中加入10 μmol/L的阿糖胞苷(AraC)抑制胶质细胞增生。

　　1.2.2 药物处理

　　脑片稳定培养的第10天进行药物处理。在培养基中分别加入终浓度为0.1，0.5，1.0,5.0 μmol/L的lactacystin[二甲基亚枫(DMSO)溶解]，设置空白对照组。继续培养24 h后终止培养，进行测定。

　　1.2.3 LDH测定

　　在培养的第1，3，5，7，9，11，13，15 d收集换液前的培养基置于EP管中，按LDH试剂盒的操作步骤进行LDH释放水平测定。

　　1.2.4 免疫组织化学染色

　　将脑片带膜浸入4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS配制，pH7.2)中4 ℃固定12 h，然后轻轻地将脑片从微孔膜上剥离，梯度酒精脱水后经二甲苯透明，常规浸蜡，石蜡包埋。每个标本制备切片6～10片，在55～60 ℃温箱中过夜烘干后进行免疫组织化学染色。切片经TritonX-100 处理，小牛血清封闭后，分别移入1∶1 000 的小鼠抗TH 和1∶2 000 的兔抗αsynuclein的一抗稀释液中4 ℃过夜(阴性对照用PBS代替一抗)，再分别移入生物素标记的抗小鼠和抗兔的二抗稀释液中，室温下孵育30 min，移入AB 液中孵育30 min ，二氨基联苯胺和过氧化氢混合液显色3～5 min。镜下观察TH阳性细胞、αsynuclein 蛋白表达分布，并进行TH阳性细胞计数。

　　取每组中随机的8张切片，每张切片计数一侧中脑黑质部的TH阳性细胞，取其均数代表该组TH阳性细胞数量。αsynuclein染色切片取每组中8张切片，应用Image pro图像分析软件进行半定量分析，单位区域内的阳性产物的灰度值表示蛋白水平。

　　1.2.5 凋亡检测

　　采用TUNEL法检测凋亡，按照TUNEL试剂盒提供的方法操作

　　1.3 统计学方法

　　所有数据均采用SPSS12.0统计软件分析，数据结果采用均数±标准误(±s)表示，对每组样本数据进行统计分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析检验，以P<0.05表示差异有显著性意义。

　　2 结果

　　2.1 脑片生长情况

　　镜下观察培养的脑片在1周以内逐渐变薄且透明，周围边界变模糊，面积变大，部分死亡脑片整体变得泥样浑浊、模糊，光镜下无法分辨结构，而生长良好的脑片镜下结构清晰，折光性强，视野中可见胶质细胞增生明显。

　　2.2 LDH测定结果

　　对不同时间点收集的空白对照组培养液中LDH活力检测后发现，培养早期(1～5 d)，释放到培养基中的LDH的活力较大，随着培养时间的延长，LDH活力迅速下降，并在第7天左右趋于稳定，结果见图1。lactacystin处理24 h后可以发现，随着药物浓度的升高培养基中LDH活力也有升高的趋势。结果见图2。图1 对照组脑片LDH水平变化 浓度(μmol/L)

　　2.3 免疫组织化学染色

　　TH免疫组化染色发现，TH阳性神经元分布于脑片的黑质部，形成多角形或梭形，一般可见2～3个较长的突起，向外延伸，阳性产物位于胞浆中，神经元胞浆和纤维均染成棕黄色,胞核则为阴性。0.1，0.5 μmol/L的lactacystin处理组与对照组比较未见明显的形态学差异。1.0，5.0 μmol/L的lactacystin处理组标本则有较大变化，可以见到部分神经元突起变短，甚至消失，并随lactacystin作用浓度的增大而更明显。对一侧中脑黑质部的TH阳性细胞应用Image pro 6.0图文分析软件系统进行计数，结果见表1，图3。表1 脑片黑质部位单侧TH阳性神经元数目(略)注：与对照组比较，*P<0.05; **P<0.01。

　　结果显示，0.1，0.5，1.0，5.0 μmol/L lactacystin组SNc TH阳性细胞数分别较对照组减少了7.08%、11.80%、62.40%和83.46%。随着lactacystin浓度的加大这种减少趋势也在加大。

　　αsynuclein 免疫组化: 0.5 μmol/L 的lactacystin处理组和对照组SNc神经元αsynuclein 表达低,胞浆着色淡;而1.0，5.0 μmol/L 处理组SNc 神经元胞浆内αsynuclein 表达增加,胞浆着色深, αsynuclein 免疫反应呈强阳性。对上述各组黑质细胞αsynuclein免疫染色采用半定量的方法，应用Image pro 6.0图像分析系统进行统计分析，用灰度值来表示αsynuclein蛋白表达的高低，结果如表2,图4。

　　2.4 凋亡检测

　　凋亡检测显示，5.0 μmol/L的lactacystin处理组可以见到TUNEL染色阳性的神经元细胞，空白对照组和0.5 μmol/L 的lactacystin处理组则未见TUNEL阳性染色细胞。这说明lactacystin在较高浓度时有促进黑质细胞凋亡的作用。结果见图5。表2 脑片黑质区αsynuclein表达(略) 注：与对照组比较，*P<0.05;**P<0.01。

　　3 讨论

　　帕金森病是以选择性的中脑DA能神经元发生退变伴细胞内Lewy body形成为主要特征的中枢神经系统变性疾病。现已证实，αsynuclein是Lewy body中的主要成分。Polymeropoulos 等[5]认为，αsynuclein基因的变异导致αsynuclein 由α螺旋转变为β折叠,引起αsynuclein 自身聚集并形成淀粉样细丝,这可能与少数遗传性PD 的发病有关。但临床上绝大多数散发性PD并未见αsynuclein 的基因变异,病理上同样存在Lewy 小体,用结构异常难以解释散发性PD中Lewy 小体形成的原因。αsynuclein是UPS的底物, 通过泛素蛋白酶体系统降解[6]，蛋白酶体功能缺陷将会导致包括αsynuclein在内的异常蛋白的聚集，破坏细胞内环境的完整和稳定性。McNaught 等[7]认为，散发性PD患者黑质细胞蛋白酶体活性明显减弱,引起αsynuclein 降解受阻和异常聚集，这一过程可能是PD发病的重要机制之一。

　　长期的中脑组织切片培养是一种较好的用于研究PD的慢性致病过程的实验模型，相对于细胞培养来说，它具有更接近在体的解剖和生理特性[8]。由于维持着各种细胞之间的相互关系，常使得不同脑区的神经元能在体外长期存活并保持良好的功能状态;相对于动物实验，它的操作更为简单、灵活，在研究过程中能够严格控制处理因素。因此可以说，这种技术兼具了细胞培养和动物实验的双重优势[3]。本实验组通过对Stoppin等的方法加以改进，成功地建立起PD 部分病理过程模型。lactacystin是一种从链酶菌中分离得到的、特异性的蛋白酶体抑制剂，能有效抑制20S蛋白酶体的活性，Reaney等[9]将lactacystin作用于大鼠中脑黑质原代细胞培养系统中并观察到其特异性的毒性作用。本实验将脑片组织暴露于蛋白酶体抑制剂lactacystin后，我们观察到了培养的中脑组织切片中黑质部位TH阳性神经元的丢失，αsynuclein免疫反应阳性率增高以及黑质细胞凋亡增加的结果;这表明蛋白酶体抑制剂对中脑脑片中多巴胺能神经元具有特异性的毒性作用，这种作用可能是通过αsynuclein蛋白异常聚集而产生的，进而增加了黑质细胞的凋亡。

　　近年来多项研究显示，PD发病过程中存在着黑质细胞的氧化应激，线粒体功能下降，泛素蛋白酶体系统功能障碍等机制，并且它们之间可能存在着相互联系、互相依存的关系，但这个过程中的因果关系目前尚未研究清楚。越来越多的研究显示，蛋白酶体系统功能障碍可能在这些病理过程中处于中心地位[10]，对它的深入研究为最终明确PD的发病原因及找到新的治疗方法提供了理论依据。

　　【参考文献】

　　1 Goedert M. αsynuclein and neurodegenerative diseases[J].Nat Rev Neurosci,2001,2(7):492501.

　　2 McNaught KS, Olanow CW, Halliwell B, et al. Failure of the ubiquitinproteasome system in Parkinson's disease[J]. Nat Rev Neurosci, 2001,2:289294.

　　3 Stoppini L， Buehs PA， Muller D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.J Nearosci Meth，1991，37(2):173182.

　　4 Testa CM, Sherer TB, Greenamyre JT. Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures[J]. Molecular Brain Research,2005,134:109118.

　　5 Polymeropoulos MH, Lavedan C, Leroy E, et al. Mutation in the alphasynuclein gene identified in families with Parkinson's disease[J]. Science,1997,276:24052407.

　　6 Lee HJ, Choi C, Lee SJ , et al. Membranebound αsynuclein has a high aggregation propensity and the ability to seed the aggregation of the cytosolic form[J]. J Bio l Chem, 2001,277:671678.

　　7 McNaught KS, Jenner P. Proteasomal function is impaired in substantia nigra in Parkinson's disease[J]. Neurosci Lett,2001,297:191194.

　　8 王玉凯，刘焯霖.MPTP对培养的Wistar乳鼠中脑器官型脑片中多巴胺神经元的作用[J].中华神经科杂志，2002，35：316318.

　　9 Reaney SH, Johnston LC, Langston WJ, et al. Comparison of the neurotoxic effects of proteasomal inhibitors in primary mesencephalic cultures[J]. Experimental Neurology, 2006,202(2):434440.

　　10 Cookson MR. Roles of the Proteasome in Neurodegenerative Disease: Refining the Hypothesis[J]. Annals of Neurology, 2004,56(3):315318.