胸腔积液中腺癌细胞甲状腺转录因子1表达的定量研究

作者：周春辉， 申 洪    作者单位：南方医科大学 病理学教研室， 广州 510515 　　【摘要】  目的 分析甲状腺转录因子1(TTF1)在胸腔积液腺癌细胞中的表达特点及规律，从量化角度探讨其作为判断胸水中转移性肺腺癌组织来源指标的临床应用价值。方法 选用胸腔积液转移性腺癌48例，其中肺源性腺癌37例，非肺源性腺癌11例。每例均制备巴氏染色细胞涂片和离心沉淀石蜡包埋细胞蜡块切片，并对相应细胞蜡块切片行HE染色和TTF1免疫组织化学染色。结果 37例肺腺癌中28例表达TTF1，11例肺外腺癌无1例表达TTF1。胸水中肺源性腺癌细胞与非肺源性腺癌细胞TTF1 PU值的比较差异具有显著性（p<0.01）。定量结果显示胸水中肺源性腺癌细胞与非肺源性腺癌细胞TTF1 PU值的频数分布无重叠，以PU值大于8作为判断肺源性腺癌细胞的诊断阈值，以PU值小于6作为判断非肺源性腺癌细胞的诊断阈值，其诊断试验评价结果显示TTF1对癌性胸水中肺腺癌细胞诊断的灵敏度为75.7%，特异度为100%。标准化阳性预告值为100％，标准化阴性预告值为80.43％，标准化准确度为87.84％。结论 在排除甲状腺癌的可能性后，TTF1作为胸腔积液细胞蜡块标本肺腺癌细胞的诊断性标志具有较高的特异性和敏感性，胸水中腺癌细胞TTF1的PU值可作为判断肺源性与非肺源性腺癌细胞的特异性诊断指标。

　　【关键词】  胸腔积液； 甲状腺转录因子1； 肺腺癌； 免疫组织化学； 定量分析

　　Quantitative study of the expression of thyroid transcription factor1 in the metastatic adenocarcinoma cells of pleural effusionZHOU Chunhui，  SHEN Hong(Department of Pathology， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China)Abstract: Objective  To explore the clinic value of thyroid transcription factor1(TTF1) as a marker for matastatic adenocarcinoma of lung origin by quantitative analysis of TTF1 in adenocarcinoma cells of pleural effusion. Methods  A total of  48 cases of malignant pleural matastatic adenocarcinoma usesd in this experiment, which were 37 adenocarcinomas from lung and 11 adenocarcinomas of extrapulmonary were diagnosed clinically or histologically. Pap stained smear and cell block were prepared from pleural effusion speciments of these cases and immunohistochemical detection of TTF1 was performed on the cell block sections. Results  TTF1 was expressed in 28 lung adenocarcinomas while  none of  the 11extrapulmonary adenocarcinomas expressed TTF1. TTF1 positive unit(PU) is bigger in lung adenocarcinomas than in those of extrapulmonary adenocarcinomas and there is a significant difference between them（p<0.01）. Conclusions  It was suggested that the TTF1 positive unit(PU) in pleural effusion might be valuable marker in diagnosis of adenocarcinoma cells in malignant pleural effusions come from lung if the thyroid carcinoma could be excluded.

　　Key words: pleural effusion; thyroid transcription factor1; lung adenocarcinoma; immunohistochemistry； quantitative study

　　胸腔积液中最常见的恶性肿瘤细胞是转移性腺癌细胞。肺腺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌等的癌细胞通过转移均可出现在胸腔积液中，以肺腺癌最为常见［1］。不少恶性肿瘤患者以胸腔积液为首发症状，且临床检查难以发现原发病灶。由于各种转移性腺癌的细胞形态相似，仅凭细胞学检查难以确定其组织来源，而判断胸水中转移性腺癌的原发部位对于临床诊断及治疗均具有重要意义。因此，胸腔积液中腺癌细胞的来源是胸腔积液细胞病理学研究中需要解决的重要问题。甲状腺转录因子1（TTF1）是近年来发现的一个新的分子标记物，位于人类染色体14q13，是NKX2转录因子家族中的一员，是一种相对分子量为38  kDa的核转录蛋白。TTF1表达于肺和甲状腺的上皮细胞、甲状腺滤泡旁C细胞、胚胎大脑的某些区域，而其它部位的腺上皮细胞如肝、胃肠道、乳腺、肾和前列腺的上皮细胞及间皮细胞均不表达［2～4］。因此，本研究通过定量检测TTF1在恶性胸腔积液不同组织来源的转移性腺癌细胞中的表达量，探讨TTF1作为胸腔积液中转移性肺腺癌细胞标志的临床应用价值。

　　1  材料与方法

　　1.1  标本收集    收集南方医院2006年6月至2007年2月癌性胸腔积液48例，其中肺腺癌37例，胃癌4例，乳腺癌3例，卵巢癌2例，子宫内膜癌1例，结肠癌1例。每例均经组织学、细胞学或结合临床资料确诊，均平行制备巴氏染色涂片和离心沉淀石蜡包埋细胞蜡块。

　　1.2  细胞蜡块的制备

　　取胸腔积液10  ml，3000  rpm，室温离心10  min，弃上清，加95%乙醇8  ml，3000  rpm离心10  min，室温静置2  h，弃上清，加10%中性福尔马林固定3  h，然后放入脱水盒按常规石蜡包埋制备蜡块。

　　1.3  免疫组织化学

　　采用鼠抗人TTF1单克隆抗体并行免疫组化SP法染色，TTF1抗体工作液浓度为1∶100。将细胞蜡块连续切片（厚约3～4  um），贴附于多具赖氨酸处理过的载玻片上。65℃烤箱烤片3  h，常规脱蜡，梯度酒精水化。1  mmol/L、PH6.0柠檬酸微波修复抗原15  min。3％H2O2室温作用10  min，以清除内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗3次。滴加非免疫性山羊血清，室温孵育15  min。滴加鼠抗人TTF1单抗，4℃过夜孵育12  h，PBS漂洗4次，每次3  min。滴加生物素标记的羊抗鼠二抗，室温孵育10  min，PBS漂洗3次，每次3  min。滴加链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液，室温孵育10  min，PBS漂洗3次，每次 3  min。显微镜下控制DAB显色时间。用于定量测试的免疫组化染色切片不复染，DAB显色时间 5  min。染色结果可疑者重复实验。以PBS代替一抗做空白对照，取肌肉组织作阴性对照，甲状腺组织做阳性对照。

　　1.4  TTF1蛋白表达的定量分析

　　根据空白、阳性和阴性对照的显色情况，在确定无假阳性和假阴性的前提下，以细胞核染成棕黄或棕褐色为阳性。用Leica Q500 MC图像分析系统在40倍物镜下从每例标本中随机选取20个视野作为该例的测试区域进行测试。每一视野随机测试10个阳性细胞，每例共测试200个阳性细胞，用交互式测试法测试每个阳性细胞核的灰度值Gα，同时在相应的20个视野中测试背景灰度Gβ并取其平均值，按文献方法计算每个阳性细胞胞核的阳性单位（PU），以每例200个阳性细胞PU均值作为该例的阳性单位［5～7］。

　　1.5  统计学分析

　　用SPSS10.0统计分析软件行卡方检验及两组计量资料t检验，计量资料检测数据以平均值±标准差（±s）表示。

　　2  结果

　　2.1  胸腔积液中转移性腺癌细胞的形态特点    37例转移性肺腺癌患者的胸水细胞巴氏染色涂片显示：肿瘤细胞聚集成团或散在分布，细胞体积增大，胞浆内可见粘液空泡，细胞核增大、偏位，异型性明显（图1）。在其细胞蜡块HE染色的切片中可见肿瘤细胞排列成腺腔样结构（图2），这些细胞学表现缺乏组织特异性。

    2.2  胸腔积液中转移性腺癌细胞TTF1的表达

    2.2.1  转移性腺癌细胞TTF1免疫组化染色结果见表1。肿瘤细胞中TTF1基因编码的蛋白产物定图1  胸水中转移性腺癌细胞（离心涂片，巴氏染色，物镜放大倍数40×）图2  胸水中转移性腺癌（细胞蜡块切片， HE染色，物镜放大倍数40×）位于细胞核，呈棕黄色（图3）。其中37例肺腺癌胸水标本中有28例标本TTF1呈不同程度的阳性表达,阳性率达75.67%，11例肺外腺癌胸水中的腺癌细胞学特点与上述37例肺腺癌胸水的细胞学特点极其相似，这11例标本TTF1免疫组化染色均为阴性，即阳性率为0%，与胸腔积液中肺源性转移性腺癌癌细胞核TTF1表达的阳性率相比，差异具有显著性（p<0.01）。图3  TTF1在胸水中转移性肺腺癌细胞内的表达，胞核阳性（细胞蜡块切片免疫组化SP法，未复染  物镜放大倍数40×）表1  胸腔积液细胞蜡块切片中不同组织转移性腺癌TTF1的表达率 注： **：p<0.01，a、 b两组比较。

　　2.2.2  转移性肺腺癌及肺外腺癌细胞TTF1表达的定量分析：我们用阳性单位定量反映TTF1的表达量，图像分析测试结果显示：癌性胸水中转移性肺腺癌细胞核TTF1的PU值明显大于乳腺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌及结肠癌细胞核TTF1的PU值。即胸腔积液中肺源性转移性腺癌癌细胞核TTF1的PU值显著大于非肺源性腺癌细胞核TTF1的PU值（p<0.01，表2）。

　　癌性胸水中肺源性腺癌细胞PU值的最小值为9.05，而非肺源性腺癌细胞PU值的最大值为5.16，两者的频数分布无重叠（图4）。因此，以PU值6和8作为两者间的判别阈值是可行的。表2  胸腔积液细胞蜡块标本转移性腺癌细胞TTF1表达的定量分析注： **：p<0.01，a、 b两组比较。图4  胸腔积液细胞蜡块标本转移性腺癌细胞

　　TTF1 PU值频数分布图

　　2.3  胸腔积液中转移性腺癌细胞TTF1表达的诊断试验评价［8～10］表3是胸腔积液中转移性腺癌细胞 TTF1蛋白检测对于肺腺癌细胞判别的诊断试验评价数据及评价结果。基于TTF1表达的阳性及阴性结果对癌性胸水中肺腺癌细胞诊断的灵敏度（Se）为75.67%，特异度（Sp）为100％，标准化阳性预告值（SPPV）为100％，标准化阴性预告值（SNPV）为80.43％，标准化准确度（SAc）为87.84％，标准化错诊率（SWDR）为12.16％。基于TTF1表达的PU值大小，以PU值6和8作为判别阈值，当PU值大于8时诊断胸水中的腺癌细胞为肺源性，当PU值小于6时诊断胸水中的腺癌细胞为非肺源性，其诊断试验评价结果同基于TTF1表达的阳性及阴性时的诊断试验评价结果（见表3）。表3  TTF1蛋白检测作为癌性胸水细胞蜡块切片肺腺癌细胞标记的诊断试验评价结果

　　3  讨论

　　转移性腺癌是恶性胸腔积液中最常见的上皮性恶性肿瘤，其常见的原发部位包括肺、乳腺、胃肠道及泌尿生殖系统，其中又以肺组织最为常见。由于全身许多组织器官都可发生腺癌，单凭病理组织形态判断胸水中腺癌细胞的来源很困难， 而仅凭细胞学涂片判断其来源则难度更大。若能借助有较强组织特异性抗体的免疫组化染色，则将有助于对胸水中转移癌原发部位的分析和判断。

　　甲状腺球蛋白（thyroglubin，TG）、前列腺特异性抗体（prostate specific antigen， PSA）和肺表面活性蛋白（SPA、SPB）是应用较早的器官特异性抗体，而TTF1则是近年来才发现的一种甲状腺和肺特异性基因的高效转录激活物，文献中报道其特异性和敏感性均高于表面活性蛋白（SPA、SPB）［11］。人类的TTF1由单一的基因位点所编码，全长约3.3  kb，包括2个外显子和一个内含子，与鼠TTF1多肽有98%同源性。在甲状腺中，TTF1能激活甲状腺球蛋白（TG）、甲状腺过氧化物酶（TPO）、Na/I转录蛋白及促甲状腺激素受体（TSHR）等基因启动子的转录活性。在肺组织中则可激活表面活性蛋白A、B、C、D及Clara细胞分泌蛋白的转录活性，在肺的形态发育中起重要作用［12～14］。在正常肺组织中，TTF1表达于成熟的肺泡Ⅱ型上皮细胞和肺导气部的支气管上皮细胞的亚段，而Ⅰ型肺泡上皮细胞始终不表达［15,16］。TTF1在肺癌的组织学研究中表明，肺癌类型不同，TTF1的表达则不同。在肺腺癌、肺小细胞癌和不典型类癌中TTF1表达率较高，而肺鳞癌、肺大细胞癌和肺典型类癌中TTF1不表达或低表达［17］。目前认为，TTF1是肺腺癌的标志物［18～20］，且因TTF1在间皮细胞中不表达，故有利于鉴别肺腺癌和间皮瘤或间皮细胞增生［21］。有关TTF1对于判断浆膜腔积液转移性腺癌原发部位的研究表明，其对肺腺癌诊断的灵敏度为54%～88.2%，特异度为98%～100%［1,22～24］。这些结果来源于用胸水制备细胞蜡块并行TTF1染色的定性分析。在胸水细胞蜡块切片的基础上定量检测TTF1染色的强度，对胸水中转移性腺癌原发部位的诊断分析价值目前尚未见报道。为此，我们基于TTF1在胸水腺癌细胞蜡块切片中的表达，对此进行了探讨。

　　本研究选用了经组织学、细胞学或结合临床资料确诊的37例肺腺癌及11例肺外腺癌患者的胸水细胞蜡块标本，对比观察了TTF1在肺腺癌和肺外腺癌中的表达，在此基础上用图像分析系统对癌细胞TTF1表达的阳性单位进行了测试，定量反映TTF1免疫组化显色反应强度，结果表明：TTF1对于癌性胸水中肺腺癌细胞诊断的灵敏度为75.7%，特异度为100%；肺源性腺癌细胞核TTF1的PU值是非肺源性腺癌细胞核TTF1 PU值的3倍之多，且两者之间的差异具有显著性（p<0.01）。

　　根据PU值定量测试结果，作者认为PU值6—8可作为判断胸水中肺源性与非肺源性腺癌细胞的诊断阈值。当PU值大于8时胸水中的腺癌细胞为肺源性，当PU值小于6时胸水中的腺癌细胞为非肺源性。虽然TTF1在甲状腺癌中同样有较高的表达［25］，但甲状腺癌很少出现在胸腔积液中。因此，胸腔积液中肺腺癌细胞TTF1蛋白的表达具有特异性高、敏感性好的特点，可作为胸腔积液中转移性肺腺癌细胞诊断及鉴别诊断的特异性指标，对于明确诊断及临床治疗研究具有重要意义。当怀疑胸水中的癌细胞可能源自甲状腺癌转移时，需要结合其它甲状腺特异性标记物加以甄别，如甲状腺球蛋白等。

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