心房颤动患者碱性成纤维细胞生长因子基因表达的研究

作者：张建成　宋伟　林亚洲　陈林　杨志平　许春萱    作者单位：1.福建省立医院，福建省心血管病研究所心内科，福建 福州 350001；2.龙岩市第一医院心内科；福建省科技厅青年科技人才创新项目(2005J067)

【摘要】  目的：检测碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在心房颤动(房颤)患者心房组织中的基因表达，探讨其与心房纤维化的关系。方法：75例风湿性心脏瓣膜病(风心病)接受换瓣手术者被分为三组：窦性心律组（34例），阵发性房颤组（11例），慢性房颤组（30例）；于术中切取右心耳组织，分别采用半定量逆转录聚合酶链反应和免疫组化技术测定bFGF mRNA含量和蛋白含量。结果：与窦性心律组比较，bFGF的mRNA和蛋白在阵发性房颤组和慢性房颤组的表达均显著上调（P均＜0.001），而且慢性房颤组的较阵发性房颤组的明显上调（P<0.05）。同时，bFGF的mRNA和蛋白水平均与房颤持续时间（分别为r=0.330,P=0.005和r=0.299,P=0.010）及左心房内径呈正相关（分别为r=0.342,P=0.003和r=0.285,P=0.015）。结论：心房组织中bFGF的基因表达上调可能参与房颤的发生和维持，与房颤的心房纤维化密切相关。

【关键词】  心房颤动　成纤维细胞生长因子　纤维化

　　Gene expression of basic fibroblast growth factor  in patients with atrial fibrillation

　　ZHANG Jiancheng，SONG Wei,LIN Yazhou，CHEN Lin,YANG Zhiping，XU Chunxuan

　　Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2009,18(6):527

　　Abstract：Objective:To investigate the  gene expression of basic fibroblast growth factor(bFGF)  in patients with atrial fibrillation(AF).Methods:The right atrial tissue samples were taken from 75 patients with rheumatic heart disease who underwent heart valve replacement surgery. In which 34 patients were in sinus rhythm,11 patients had paroxysmal AF and 30 patients had chronic AF. The mRNA and protein level of bFGF was measured by semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and immunohistochemical technique.Results:Compared to sinus rhythm group，the expression levels of mRNA and protein of bFGF  significantly increased in the paroxysmal AF group and chronic AF group(P＜0.001 all),and the levels of mRNA and protein of bFGF significantly increased in chronic AF group compared with those of paroxysmal AF group（P<0.05 all）. The mRNA and protein level of bFGF was positively correlated with AF duration(r=0.330,P=0.005 and r=0.299,P=0.010,respective) and left atrial dimension(r=0.342，P=0.003 and r=0.285,P=0.015,respective).Conclusion:The increased level of bFGF gene expression in atrium could be involved in the molecular mechanisms of atrial fibrosis during fibrillation，which might correlate with the initiation and maintenance of atrial fibrillation.

　　Key words：Atrial fibrillation；Fibroblast growth factor；Fibrosis    　　心房颤动（房颤）是临床上最常见的复杂而快速的心律失常之一，心房间质纤维化是其发生、维持的一个重要因素[1～4]，而心肌纤维化主要与心肌成纤维细胞增多及功能增强，过度合成胶原有关。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是一种新发现的，促成纤维细胞分裂和胶原沉积的生长因子。本研究观察了bFGF在风湿性心脏病（风心病）合并房颤患者心房组织中mRNA和蛋白表达的改变，探讨其与房颤患者心房纤维化的关系。

　　1  资料与方法

　　1.1  一般资料      　　75例风心病接受开胸换瓣手术患者，男32例，女43例，年龄16～64，平均（41.78±11.42）岁。分三组：窦性心律组34例，阵发性房颤组11例，慢性房颤组30例。术前常规行心电图、超声心动图等检查。所有病例心功能均在Ⅱ ～Ⅲ级(NYHA分级)。患有甲状腺功能亢进、高血压病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、扩张型心肌病、慢性肺原性心脏病和近期(5个药物半衰期)内服用了血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂和醛固酮受体拮抗剂类药物的病例不纳入本研究。

　　1.2  研究方法

　　1.2.1  标本采集: 心脏手术中建立体外循环，心脏停跳前获取右心耳组织约250mg，除去血液和脂肪组织后迅速置入液氮，然后转入-70℃深低温冰箱冻存，备用。

　　1.2.2  bFGF mRNA表达的检测:(1)RNA提取:取组织约100 mg， Trizol ( Gibco公司)一步法提取总RNA；（2）半定量逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR):参照TaKaRa公司试剂盒进行，引物及各目标基因褪火温度见表1；(3)电泳及图像扫描:同一反应体系中β肌动蛋白（β-actin）和目标基因扩增产物电泳后在ImageMaster VDS-CL凝胶成像系统上扫描，测两条带A值，用其A值的比值代表目的基因的相对表达量。

　　1.2.3  bFGF蛋白表达的检测：（1）检测方法： MaxVision免疫组织化学方法。每张石蜡切片加 50μl第一抗体兔多抗(福州迈新生物公司)，室温下孵育 60 min，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗 3次，每张切片滴加 50 μl MaxVisionTM试剂(美国 Maxim公司)，室温下孵育 10～15 min，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，观察；（2）免疫组织化学半定量分析：每份标本随机选取5个高倍视野（×400倍），采用免疫组化分析软件(imagepro plus，IPP)在SigmaScan4.0图像分析系统上，对选取视野内免疫组化阳性信号进行图像分析，测定心肌间质阳性颗粒的累积光密度（integrate optical density，IOD），值越大表明组织中该蛋白表达量越多。表1  目标基因与内参基因引物位置及聚合酶链式反应条件(略)

　　1.3  统计学处理

    计量资料以均数±标准差(±s)表示，各项指标组间比较采用单因素方差分析，各项指标间的数量关系采用直线相关分析。统计处理均由SPSS13.0软件包完成，P<0.05为差异有显著性。

　　2  结  果

　　2.1  患者临床特征

    见表2。房颤患者左心房明显扩大（P<0.05），慢性房颤患者房颤持续时间明显长于阵发性房颤患者（P<0.001），各组间其他临床资料如性别、年龄、左室射血分数和心功能NYHA分级等差异无显著性。表2  研究对象一般资料的比较(略) 注：与窦性心律组比较△P<0.05，△△P<0.001；与阵发性房颤组相比▲ P<0.05，▲▲P<0.001。下表同。    　　2.2  bFGF mRNA转录水平    　　见表3、图1。与窦性心律组相比，阵发性房颤患者、慢性房颤患者心房组织中bFGFmRNA表达均显著上调（P均＜0.001），而且慢性房颤组的较阵发性房颤组亦明显增高（P＜0.05）。bFGF的mRNA水平还与房颤持续时间（r=0.330,P=0.005）及左心房内径（r=0.342,P=0.003）呈正相关。而bFGFmRNA水平与性别、年龄、左室射血分数、心功能分级等参数无关。

    　表3  各组间目标基因mRNA转录水平的比较(略) 注：β-actin=β肌动蛋白；M=Marker；1=窦性心律组；2=阵发性房颤组；3=慢性房颤组；4=阴性对照。

　　2.3  bFGF蛋白表达    　　见表4、图2（见封四）。各基因蛋白染色阳性信号为棕色颗粒，其中bFGF大量表达于心房肌细胞浆，也表达于成纤维细胞；与窦性心律组相比，bFGF蛋白在阵发性房颤患者（P＜0.05）、慢性房颤患者（P＜0.001）心房组织中表达均显著上调，而且慢性房颤组相对于阵发性房颤组亦明显增高（P＜0.05），同时bFGF的蛋白水平与房颤持续时间（r=0.299,P=0.010）及左心房内径（r=0.285,P=0.015）呈正相关。bFGF蛋白水平与性别、年龄、左室射血分数、心功能分级等参数无关。表4  各组间目标基因蛋白表达水平的比较(略)

  　  3  讨  论    　　心肌纤维化主要表现为心肌间质中胶原沉积增多，各型胶原比率失调和排列紊乱。有研究发现在房颤动物模型和房颤患者心房组织中均存在显著的纤维化[1～4]，同时胶原表达明显增加，且与房颤时程及心房内径密切相关[3～6]，但迄今为止，对于房颤患者心房中胶原过度合成的详细机制，特别是bFGF是否参与其中还知之甚少。

   　 本实验首次在心房组织中观察到，风心病慢性房颤患者心房组织中bFGF mRNA 转录水平、蛋白表达水平显著高于阵发性房颤组和窦性心律组，阵发性房颤组bFGF mRNA 和蛋白表达水平也较窦性心律组明显增高，同时bFGF的mRNA及蛋白表达水平与房颤的持续时间呈正相关，提示房颤患者心房组织中bFGF基因表达增加，且与房颤时程密切相关。增高的bFGF可能通过促进成纤维细胞增殖和胶原合成增加，促进心房纤维化，引起心房局部组织的传导特性的改变，引起不连续的冲动传导及传导的空间分布离散而增加心房内折返子波数，促使房颤的发生和维持。在动物模型的研究中发现[1]，血液动力学超负荷可刺激心肌细胞分泌多种生长因子，进而通过自分泌－旁分泌作用诱导心肌肥大，包括心肌细胞肥大和心肌胶原纤维增生，其中bFGF可能发挥了重要的调控作用。本研究，房颤患者心房内径明显大于窦性心律患者，同时bFGF的mRNA和蛋白表达与左心房内径呈正相关，我们推测左房容积负荷或机械负荷的增加可能刺激心肌细胞分泌bFGF，加剧心房胶原纤维增生，是引起心房胶原重构的另一原因，同时扩大的心房能容纳更多的折返子波，从而促使房颤的发生和维持。

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　　［3］林亚洲，陈 林，许春萱，等.心力衰竭犬心房组织I型胶原、基质金属蛋白酶-2及组织抑制因子与心房纤维化和颤动的关系［J］.中华老年医学杂志，2006，25（2）：141-145.

　　［4］吴国盛，许春萱.心房纤维化与心房颤动机制［J］.心血管康复医学杂志，2008，17(6)：590-592.

　　［5］Xu J，Cui G，Esmailian F，et al. Atrial extracellular matrix remodeling and the maintenance of atrial fibrillation［J］.Circulation，2004,109:363-368.

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