抑肽酶对冠脉阻力及其内皮细胞功能的影响

作者:张红超,于鲁峰,黄菊梅作者单位：1.空军总医院心外科, 北京 100036； 2.美国西南医学中心外科中心实验室,美国 达拉斯,75390

   【摘要】  　　目的 观察体外循环（extracorporeal circulation，ECC）瓣膜置换手术中抑肽酶和温血心肌灌注对心肌中内皮细胞（endothelial cell，EC）功能变化及其与冠状动脉阻力（coronary artery resistance，CAR）变化的关系的影响。方法 随机选取风湿性心脏病（RHD）的二尖瓣置换（MVR）病例。A组（对照组）：RHD瓣膜置换术，B组（实验组）：RHD瓣膜置换术＋抑肽酶，两组均为20例。所有患者于阻断开始、阻断30min、阻断60min、开放前温血灌注末留取静脉血标本，待分离循环系统内皮细胞（circulating endothelial cells，CEC），测定血小板颗粒膜蛋白(GMP-140)、 6-酮-前列腺素F1α(6-K-F1α) 、组织型纤活酶激活物(t-PA)。记录每次心肌灌注的压力及流量。结果 ECC中各组CEC均升高，尤其是在阻断60 min时；A组CEC的变化显著高于B组。与EC分泌相关的因子在阻断60 min时有相应的升高，比较明显的是6-K-F1α(B组显著高于A组), 并且其高峰滞后。B组在阻断60 min和末次温血灌注中冠脉阻力明显低于A组。结论 在心脏停搏下手术时，EC功能与冠脉血管的张力调节密切相关，抑肽酶可以保护主动脉阻断温血灌注中EC的调节功能。

【关键词】  体外循环　内皮细胞　风湿性心脏病　　冠状动脉阻力

　　The  Effect of Aprotinin on the Variety of Coronary Artery

    Resistance and the Function of Endothelial Cell during

    Heart Arrest with Warm Blood Cardioplegia

    ZHANG Hong-chao1,YU Lu-feng1,HUANG Ju-mei1,LI Wei-hong1,YANG Jun-min1,TAO Weike2

    (1.The Cardiac Surgery Department,the General Airforce Hospital,Beijing 100036,China;

    2.The Surgery Core Lab, Southwestern Medical Center,Dallas  75390,American)

    Abstract: OBJECTIVE   To observe the variations of the function of endothelial cell and coronary artery resistance(CAR) during heart arrest with warm blood cardioplegia with or without aprotinin. METHODS  40 patients suffered rheumatic heart disease were selected randomly. 20 of them were administered aprotinin during extracorporeal circulation (ECC) as group B  (study group),others without apotinin as group A (control group). The blood samples were taken at aortic clamping,30min,60min after aortic clamping,and end warm blood perfusion. The tissue-plasminogen activator (t-PA),the platelet granulate membrane protein 140 (GMP140) and the 6-keto-PGF1α(6-K-F1α) ，circulating endothelial cell(CEC)were observed. The pressure and flux were recorded during warm blood cardioplegia. RESULTS  ECC led  CEC to increase，which peaked  at 60min after aortic crossclamp. The EC related proteins increased at that time,but the peak of 6-K-F1 in group A delayed than that in group B. CAR of group B was significantly lower than that of group B at 60 min after aortic crossclamp. CONCLUSION  ECC leads to  excessive activation, injury and dysfunction of EC,while aprotinin can attenuate this process.

    Key words：  Extracorporeal circulation;Endothelial cell;Rheumatic heart disease;Coronary artery resistance

  体外循环（extracorporeal circulation,ECC）损伤血管内皮细胞的途径有血管痉挛、凝血病理改变、缺血再灌注损伤、全身炎性反应以及药物等［1］，内皮细胞(endothelial cell，EC)的病理变化又影响着患者的整个病程和预后，尤其对ECC术后心功能恢复有重要意义。本研究利用分离脱落于循环系统内皮细胞(circulating endothelial cells，CEC)的方法，观察了ECC中应用抑肽酶对EC损伤及冠状动脉阻力（coronary artery resistance，CAR）变化的影响。

    1  资料与方法

    1.1  临床资料和手术方法

    1.1.1  分组和选择标准  随机选取40例风湿性心脏病（RHD）行二尖瓣置换术（MVR）的病例分为两组，每组各20例: 对照组（A组）不使用抑肽酶；实验组（B组）使用抑肽酶。

    选择患者的标准为：①无使用影响凝血机制的药物及凝血系统病史；②心功能Ⅱ－Ⅳ级，无冠心病史；③无肝、肾功能不良病史；④无风湿活动(血沉及抗链球菌溶血素O正常)。有使用止血剂和抗凝剂者，排除观察范围。

    抑肽酶的用法和剂量：抑肽酶(特血乐，Trasylol)为德国拜耳(Bayer)公司产品，于麻醉诱导后静脉滴注1万KIU观察10 min，无心率、血压改变，无皮疹出现者于开胸前滴完100万KIU，另外200万KIU抑肽酶一次性加入到预充液中，共使用抑肽酶300万KIU。

    1.1.2  手术方法  大剂量芬太尼(20 μg/kg )和肌松剂(Tracurium)诱导，气管插管后吸入异氟烷全麻，胸骨正中切口，常规建立ECC，全部患者均采用美国产Sarns9000型滚柱泵和西京87型鼓泡氧合器，中低温(25℃～27℃)，中度血液稀释，流量50～80 ml/（kg·min)，肝素用量：晶体预充液1 mg/100ml 、血制品预充液4 mg/100 ml、体内3.5 mg/kg，ECC中以高岭土激活全血凝固时间(K-ACT，480～600s)指导肝素用量，尽管抑肽酶对K-ACT时间无明显影响，但在B组中仍将ACT维持在稍长水平（750 s左右）。术后常规ICU监护，酌情使用正性肌力药物和血管活性药物，术后和术后第一天分别静脉使用地塞米松10 mg各1次，使用抗生素预防感染，监测血常规、肝肾功能、电解质和血气的变化。

    1.1.3  记录指标和标本采取  所有患者于升主动脉开始阻断后、阻断开始30 min、60 min和开放前温血灌注末留取静脉血标本，记录每次温血灌注心肌保护的压力及流量，阻力计算为：压力(mmHg)/流量（ml/min）［2］，同时记录肝素化后、ECC 45 min和90min时K-ACT、肝素使用总量、ECC时间、术后24 h胸管引流量和输血量。

    1.2  实验材料和检测方法

    1.2.1  样本处理  将所有采得血样取2 ml按9∶1以2％的乙二胺四乙酸钠抗凝，以3000 rpm离心，收取血浆于EP管中，-40℃冻存。各时点单取静脉血5 ml，以3.8％枸椽酸钠抗凝0℃～4℃保存，待分离CEC。标本采取处理过程中避免接触玻璃器皿，主要使用塑料注射器和试管。

    1.2.2  所用试剂盒及主要仪器  血小板颗粒膜蛋白(GMP-140)、 6-酮-前列腺素F1α(6-K-F1α)酶标试剂盒(苏州医学院血栓研究室提供)。组织型纤活酶激活物(t-PA)发色底物法试剂盒(福建太阳生物技术公司提供)。检测仪器为自动酶标仪，全自动生化分析仪。

    1.2.3  标本的检测  酶联免疫吸附法(ELISA法)测定6-K-F1α、GMP-140。发色底物(Chromogenic Substances)法测定t-PA。CEC的分离和测定［3］:在I.Wata等的方法基础上采用分次离心沉淀法分离CEC，取血样5 ml加入ADP 200 ug，充分混匀后静置于37℃水浴中15 min，以395 g离心20min，收集上清液以1200 g离心10 min，弃去上清液，加入0.9％ NaCl 0.1 ml充分振荡10 min，用Olympus光学显微镜在血细胞计数池中计数，同一标本共计数四次，取其均值，单位为n/ul。同时做细胞涂片，用兔抗人ⅧR∶Ag血清和异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔IgG荧光抗体进行荧光标记，荧光显微镜下所见的免疫荧光细胞即CEC，计算阳性率。

   1.3  数据统计处理  应用SPSS 13.0软件进行统计分析，两组数据进行t检验分析,用均数±标准差(±s )表示，P<0.05为有显著性差异。

    2  结  果

    2.1  两组患者一般情况  两组患者按随机对照,一般指标中除B组出血量明显减少外,其它指标未见显著差异,见表1。

    2.2  ECC中EC分泌功能的变化及CEC的鉴定  以免疫荧光标记来鉴定的CEC的纯度，发现其荧光染色阳性率为(89.2±4.1)％，CEC记数结果均以此值校正。ECC中各组CEC均升高，尤其是在阻断60 min；A组CEC的变化显著高于B组。阻断60 min表1  两组病例一般情况注：*两组间相比P＜0.05表2  心脏停跳中相关参数的改变注：*与术前比，P＜0.05；**与术前比，P＜0.01；△组间比较P<0.05

    时两组中与EC分泌相关的因子相应升高，比较明显的是6-K-F1α，B组高于A组，且高峰滞后。见表2。

    2.3  冠状动脉灌注阻力变化  主动脉阻断中，B组在阻断60 min和末次温血灌注时冠脉阻力明显低于A组，尤其在末次温血灌注时差异更为显著(P＜0.01)。见图1。

    3  讨  论

    当血液受外在因素的影响时,EC充分发挥其对血液系统的保护作用，但这种保护作用是有限度的，当EC自身也受到损伤时,不仅其屏障作用减弱,甚至会加重原有的病理过程［1］。EC损伤除了破坏血管壁的完整性之外，其调节凝血功能的作用也发生改变，表现为具有促栓作用的因子(Ⅴ、Ⅷ、TF、vWF、PAF、Fn、内皮素等)与具有抗栓作用的因子(肝素样物质、NO、PGI2、t-PA、TM等)间的失衡，进一步损伤表现为EC的坏死与脱落。心脏外科疾病的病理改变中，血流动力学异常、缺氧及感染等都是EC损伤的因素；在ECC中控制性低血压、低温、全身炎性反应及一些药物都可致EC损伤。EC损伤可以导致白细胞、血小板的黏附增加、促使凝血和纤溶的激活及微血管痉挛等［4-5］，特别是EC对血管张力的调节能力的损伤对缺血再灌注心肌非常不利。因此，了解EC损伤的程度对血液保护、内皮保护以至心肌保护十分必要，当前用测定血液中血管性假性血友病因子相关抗原(vWF:Ag)、前列环素(PGI2)、血栓调节蛋白(thrombomodulin, TM)和t-PA等方法来判断EC功能，但是以上指标的特异性都较差，而CEC则是一种直接的、特异性高的方法［3］。因此，我们采用形态识别结合荧光鉴别的方法测定CEC。并将这一结果和同时监测的可以反应内皮细胞功能的指标(t-PA活性、6-K-F1α、GMP-140的含量)比较，其中6-K-F1α是PGI2的代谢产物，可以反应PGI2的代谢水平。

    抑肽酶是目前公认减少全身炎性反应的有效药物［6-7］，本文观察了在温血灌注心肌保护中冠脉血管阻力变化的规律，没有观察全身血管阻力变化的原因是它受药物、温度、神经体液因素影响较多［8］。观察冠脉阻力可以最大程度排除这些因素的影响，增加了观察的客观性。在所有观察病例中随着ECC的延长CEC增多，使用抑肽酶可使ECC导致的CEC减少。ECC使t-PA、6-K-F1α、GMP-140也随着主动脉阻断延长而增高，B组6-K-F1α在阻断60min后显著高于对照组，且其高峰滞后，可能是因为PGI2与t-PA、GMP-140从EC中释放的特点不同 ［9］。这一差异与冠脉阻力的变化相一致，提示ECC中应用抑肽酶引起的冠脉阻力变化是与EC的功能变化相关的。由此可以提示，在心脏停搏下手术时，EC的功能与冠脉血管的张力调节密切相关，抑肽酶可以减弱主动脉阻断温血灌注中EC的损伤，保护了EC的功能，所以使用抑肽酶可以保护冠状动脉的调节能力，使得在主动脉阻断后期CAR的改变明显减少。二者支持抑肽酶的内皮保护作用。

【参考文献】  　　［1］ Verrier ED,Boyle EM Jr. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery［J］. Ann Thorac Surg,1996,62(3):915-922.

［2］ Hataishi R, Zapol WM, Bloch KD,et al. Inhaled nitric oxide does not reduce systemic vascular resistance in mice［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006,290(5):H1826-1829.

［3］ Lee KW, Blann AD, Lip GY. Plasma markers of endothelial damage/dysfunction, inflammation and thrombogenesis in relation to TIMI risk stratification in acute coronary syndromes［J］. Thromb Haemost，2005，94(5):1077-1083.

［4］ Boyle EM,Verrier ED,Spiess BD. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the procoagulant response［J］. Ann Thorac Surg, 1996，62(5):1549-1557.

［5］ Boyle EM Jr,Pohlman TH,Johnson MC,et al. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the systemic inflammatory response ［J］. Ann Thorac Surg， 1997，63(1):277-284.

［6］ Rubens FD,Mesana T. The inflammatory response to cardiopulmonary bypass: a therapeutic overview ［J］. Perfusion,2004,19(Suppl 1):S5-12

［7］ Wan S,LeClerc JL,Vincent JL. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass:mechanisms involved and possible therapeutic strategies ［J］.Chest,1997，112(3):676-692.

［8］ Tao W, Maass DL, Johnston WE, et al. Murine in vivo myocardial contractile dysfunction after burn injury is exacerbated by pneumonia sepsis ［J］.Shock,2005,24(5):495-499.

［9］ Murkin JM. Cardiopulmonary bypass and inflammatory response: a role for serine protease inhibitors［J］? J Cardiothorac Vasc Anesth,1997,11(2 supp11):19-23