抑制MCF7乳癌细胞VEGF表达对树突细胞免疫功能影响
发表时间：2009-07-23 浏览次数：596次
作者：王海燕,谭丽莉,江彩玉,葛银林 作者单位：1 青岛大学医学院附属医院输血科，山东 青岛 266003； 2 青岛市医疗保险管理中心； 3 青岛大学医学院生物化学教研室
【摘要】 目的 探讨抑制MCF7乳癌细胞血管内皮生长因子（VEGF）的表达对树突细胞（DC）免疫功能的影响。方法针对VEGF基因设计小干扰RNA（siRNA）,以脂质体转染法将 siRNA导入乳癌细胞MCF7，RTPCR 检测干扰VEGF基因后mRNA的表达，Western blotting法检测VEGF蛋白的表达，观察VEGF基因沉默效果。以MCF7 乳癌细胞的培养上清和干扰VEGF基因后MCF7 乳癌细胞培养上清液同时添加粒单细胞集落刺激因子、白细胞介素4、肿瘤坏死因子α培养正常异基因DC，利用MTT法和Hoechst33258检测DC刺激正常外周血T细胞增殖的能力及DC激发的细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤活性;ELISA法检测DC培养上清液中白细胞介素12（IL12）及DC与外周血单个核细胞(PBMC)共同培养液中干扰素γ（IFNγ）的含量。结果 VEGF基因经siRNA处理24 h后，MCF7 乳癌细胞VEGF mRNA和蛋白的表达明显降低，其诱生的DC与MCF7 乳癌细胞培养上清液诱生的DC相比, siRNA处理DC刺激T淋巴细胞增殖能力、CTL杀伤活性以及DC分泌IL12和协同刺激外周血PBMC分泌INFγ的能力明显增强。结论 siRNA可靶向抑制乳癌MCF7 细胞VEGF的表达，下调VEGF后的MCF7 细胞上清液对DC分化成熟及功能的抑制作用明显降低。
【关键词】 树突细胞；血管内皮生长因子；RNA干扰；MCF7细胞
THE INFLUENCE OF SUPPRESSION OF VEGF EXPRESSION SECRETED BY MCF7 BREAST CANCER CELL ON IMMUNE FUNCTION OF DENDRITIC CELL WANG HAIYAN, TAN LILI, JIANG CAIYU, et al (Department of Blood Transfusion, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); ［ABSTRACT］ Objective To investigate the effect of inhibition of VEGF on immune function of dendritic cell (DC) secreted by MCF7 breast cancer cells. Methods siRNAVEGF was constructed and transfected into MCF7 breast cancer cell by using cationic liposome Lipofectamine 2000TM as transfecting agent, the changes of VEGF gene expression were measured by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR), and Western blotting in vitro, the VEGF silencing result was observed. Mononuclear cells were cultured in the culture supernatants from fresh primary MCF7 cells (control group) and from siRNAVEGF treated MCF7 cells (siRNAVEGF group) with granulocytemacrophage colony stimulating factor (GMCSF), interleukin 4 (IL4) and tumor necrosis factorα (TNFα). The proliferative ability of T cells from healthy volunteers stimulated by DCs and the tumoricidal activity of CTL primed by DCs were measured by MTT assay and Hoechst33258. The concentrations of IL12 in the supernatant of cultured DCs and IFNγ in the supernatant of cocultivated DCs periphra1 blood mononuclear cells (PBMC) were detected by ELISA. Results siRNA directed against VEGF gene effectively downregulated the expression of VEGF in the level of mRNA and protein. The tumoricidal activity against MCF7 breast cancer cells, and the concentration of IL12 secreted by DCs and IFNγ produced by PBMC were all significantly higher than that in the control group. Conclusion siRNA can aim at VEGF secreted by MCF7 cells to inhibit its expression, the inhibition of the supernatant from MCF7 cells on DCs decreased markedly after VEGF gene was downregulated by siRNA.
［KEY WORDS］ Dendritic cell; Vascular endothelial growth factors; RNA interference; MCF7 cell
在机体正常和异常免疫系统中，树突细胞（DC）是功能最为强大的专职抗原递呈细胞(APC)，是触发免疫应答的核心因素，在正常肿瘤免疫中发挥重要的作用[1,2]。有报道肿瘤细胞分泌的可溶性因子能够抑制DC的产生、分化和成熟，对肿瘤宿主DC的数量和功能缺陷起着重要的调控作用，从而抑制机体对肿瘤细胞的免疫杀伤作用[3～5]。血管内皮生长因子（VEGF）是肿瘤细胞分泌的可溶性因子的一种，在肿瘤血管的生成中起着关键作用，其是否在机体的肿瘤免疫抑制中也起着关键的作用呢？本研究依据iRNA原理[8]，以MCF7乳癌细胞株作为研究对象，在mRNA水平上关闭VEGF基因的表达，观察VEGF基因沉默前后肿瘤细胞分泌的上清液对DC功能的影响，以进一步探讨VEGF在肿瘤DC免疫抑制机制中的作用，为乳癌的临床治疗寻找新的靶点。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂及引物 Lipofectamine 2000TM及TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；AMV 逆转录试剂盒、兔抗VEGF多克隆抗体（sc507）、ECL发光试剂分别为美国Promega公司、Santa Cruz公司和北京普利莱公司产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)为美国Sigma公司产品；人白细胞介素12（IL12）和干扰素γ（IFNγ）的ELISA检测试剂盒均购自深圳晶美生物工程有限公司；粒细胞巨细胞集落刺激因子(GMCSF)、白细胞介素4（IL4）及肿瘤坏死因子α(TNFα)购自Peprotech公司。Hoechst33258由碧云天生物试剂公司提供；所有引物均由上海生工公司合成。
1.1.2 细胞株 乳癌MCF7细胞株购自中国协和基础学院细胞中心。常规培养于含体积分数0.10的胎牛血清的RPMI 1640（PAA公司产品）培养液中，置于37 ℃、体积分数0.05的CO2饱和湿度的孵箱中培养传代。
1.2 小干扰RNA（siRNA）的设计合成
在美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中获取人VEGF mRNA的全长序列(其序列号为:AB021221)，结合设计软件和文献[9,10]报道，确定VEGF siRNA和阴性对照siRNA SCR（scramblesiRNA）序列分别为：5′GGAGUACCCUGAUGAGAUCUU3′(正义链)，5′GAUCUCAUCAGGGUACUCCUU3′(反义链)；5′GCGUAACGCGGGAAUUUACUU3′(正义链)，5′GUAAAUUCCCGCGUUACGCUU3′(反义链)。上述两段siRNA序列均行BLAST比对检查以保证和其他基因没有同源性，并且对VEGF siRNA序列末端均进行甲基化修饰（黑斜体所示修饰位点），由上海吉凯生物技术有限公司化学合成。
1.3 转染
根据Lipofectamine 2000TM试剂操作指南，采用通用型荧光标记的阴性对照siRNA 进行转染条件的优化。取对数生长期的MCF7细胞,调整细胞的密度，接种于12孔培养板，采用含体积分数0.10的血清（不含抗生素）的PRMZ 1640培养液培养，次日细胞贴壁后弃去旧培养液待转染。设立空白对照组、脂质体组、不同浓度（50、100、200 nmol/L）的siRNA组和siRNA SCR 转染组，siRNA与Lipofectamine 2000TM分别用适量不含血清和抗生素的RPMZ 1640稀释，5 min内将其混合，室温下静置20 min后加入细胞孔中，细胞置于培养箱常规培养，6 h后荧光显微镜下观察。选择siRNA与Lipofectamine 2000TM最佳转染比例。
1.4 半定量 RTPCR 检测VEGF mRNA的水平
收集转染24 h细胞，按照Trizol试剂盒操作说明提取细胞总RNA, 所提RNA溶于50 μL无酶水中，Eppendorf核酸定量测定仪测定RNA浓度和纯度，并在8 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，观察RNA完整性。将1 g总RNA在20 μL体系中行逆转录反应，取cDNA后续25 μL体系行PCR反应，并以无酶水作为阴性模板对照。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min, 94 ℃变性90 s，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s；33个循环后,72 ℃延伸7 min。VEGF上游引物序列:5′CCTTGCTGCTCTACCTCC3′，下游引物:5′AAATGCTTTCTCCGCTCT3′，扩增产物长序列为421 bp；内参照GAPDH上游引物序列：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′，下游引物：5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′,扩增产物长为226 bp。PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，观察并拍照,并应用天能分析软件对条带进行吸光度（A）扫描，检测各组VEGF mRNA扩增产物与其对应的内参GAPDH mRNA扩增产物吸光度值，然后将AVEGF/AGAPDH的比值进行统计学分析。
1.5 Western blotting检测VEGF蛋白的表达
常规消化收集已转染48 h的细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗2次，弃上清，加入细胞裂解液[1 g/L十二烷基磺酸钠(SDS), 100 mg/L苯甲基磺酰氟（PMSF），体积分数0.01的NP40，5 g/L去氧胆酸钠,0.2 g/L 叠氮钠,1 mg/L抑蛋白酶肽（Aprotinin），150 mmol/L的NaCl以及50 mmol/L TrisHCl，pH 7.5] 冰上充分裂解，4 ℃、12 000 r/min离心5 min,收集上清液定量，取100 μg蛋白上样，在120 g/L的SDSPAGE上电泳, 蛋白充分分离后，转移到PVDF膜(Sigma 公司)上，于含50 g/L脱脂奶粉的封闭液中4 ℃过夜。VEGF一抗1∶300 稀释，室温孵育2 h, 二抗1∶2 000稀释，室温孵育1 h，ECL发光试剂对PVDF膜进行显色反应，X线下曝光、拍照。对条带行吸光度扫描，检测各组VEGF蛋白和内参βactin蛋白所对应条带吸光度值，将AVEGF/Aβactin比值进行统计学分析。
1.6 MCF7乳癌细胞培养上清液的制备和收集
传代培养MCF7乳癌细胞，用含体积分数0.10的胎牛血清的RPMI 1640培养液将细胞的密度调整为1×109/L，置于6孔板中，在37 ℃、饱和湿度、体积分数0.05的CO2环境下培养48 h，600 r/min 离心5 min，收集培养上清液，标记为sVEGF(对照)；同样条件培养另一6孔板将细胞的密度调整为2×109/L，以100 nmol/L siRNA转染24 h后，培养液漂洗2次，去悬浮凋亡细胞后，换液，培养48 h收集培养上清液，标记为siRNAVEGF。
1.7 DC的体外培养
取正常人外周血，用PBS将抗凝血稀释1倍混匀，将淋巴细胞分层液(Ficoll)与稀释血液按体积比例1∶1混匀后，以2 000 r/min 离心25 min。用毛细吸管轻插至白膜层，沿管壁周缘吸出界面层细胞，移入另一无菌刻度离心管中，用5倍体积的PBS洗涤、离心，以1 500 r/min离心10 min，去上清液。重复洗涤3次，无血清RPMI 1640重悬细胞，调整细胞悬液密度为1×109/L。接种于24孔培养板，每孔1 mL。在37 ℃、饱和湿度、体积分数0.05的CO2环境下贴壁2 h，吸去未贴壁细胞， 以无血清RPMI 1640轻轻振荡洗涤1次(未贴壁细胞收集至另一培养瓶用于T细胞培养)，再次贴壁2 h后，吸去上清，贴壁细胞以体积分数0.10的FCS RPMI 1640培养，分别以半量添加sVEGF为对照组，以半量添加siRNAVEGF为实验组，两组同时加入细胞因子GMCSF（100 μg/L）、IL4（10 μg/L），隔日半量换液，诱导至第6天加100 μg /L的TNFα刺激DC成熟，观察细胞变化,第8天后收获DC。
1.8 Hoechst33258 染色检测MCF7细胞凋亡
取对数生长期的MCF7细胞爬片过夜使其贴壁，转染VEGF siRNA 72 h后，吸净培养液,固定液(体积分数0.75的甲醇+体积分数0.25的冰醋酸)4 ℃固定10 min, PBS漂洗2次,加入5 mg/L Hoechst33258，37 ℃避光染色10 min，再次PBS漂洗后封片,荧光显微镜下观察。
1.9 负载肿瘤抗原的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的制备
将DC体外培养的悬浮细胞置于37 ℃、饱和湿度、含体积分数0.05的CO2恒温培养箱内培养过夜，收集细胞于离心管中，以RPMI 1640洗涤，收集离心沉降细胞即为T前体细胞。用含有0.005 g/L的刀豆素A和2×105U/L IL2的RPMI 1640培养基重新悬浮，收集不黏附细胞，每2 d用含有2×105U/L IL2的RPMI 1640培养液换液，培养8 d以后获得T淋巴细胞。取1×106个对数生长期的MCF7细胞于液氮和37 ℃反复冻溶3次,制备肿瘤抗原（TAA）粗提物,实验组加入培养至第6天的DC，继续培养负载抗原48 h。将TAA致敏的DC与T淋巴细胞以1∶20的比例混合共培养2 d，收获悬浮T淋巴细胞，作为CTL。
1.10 MTT法检测树突细胞介导的CTL细胞的肿瘤杀伤效应
选用96孔培养板，每孔总液量200 μL，按效靶比（E/T）10∶1、25∶1及50∶1分别加入CTL和MCF7细胞。每个实验孔设2个复孔，每个效靶比分2组进行杀伤实验，每组设立3个复孔，于37 ℃、饱和湿度、体积分数0.05的CO2条件下将MCF7细胞培养18 h后，加入CTL。培养48 h，加5 g/L MTT每孔20 μL,孵育4 h,弃上清,每孔加DMSO 150 μL,振荡10 min,使结晶充分溶解,在酶联仪上570 nm 波长处测各孔吸光度（A）值,按下列公式计算杀伤效应。CTL杀伤效应=(实验组A值-靶细胞自然释放A值-效应细胞自然释放A值)/ (最大释放A值-靶细胞自然释放A值)×100%。
1.11 ELISA法检测IL12与IFNγ水平
利用ELISA法检测DC自分泌IL12水平，检测步骤按照说明书进行。将各组DC与正常外周血单个核细胞(PBMC)以10∶1比例混合培养,72 h后收集培养清液,检测DC协同分泌IFNγ水平。
1.12 统计学处理
应用SPSS 12.0及PPMS 1.5[7]统计学软件进行数据处理，样本间的均数比较采用t检验。
2 结果
2.1 VEGF mRNA表达的变化
RTPCR检测结果显示，50 nmol/L的siRNAVEGF组、脂质体组、错义序列组VEGF mRNA表达与对照组相比较均无明显差异；100、 200 nmol/L的siRNAVEGF组VEGF mRNA表达与对照组比较有明显差异；而100、200 nmol/L的siRNAVEGF组间比较无明显差异（图1）。
2.2 VEGF siRNA对MCF7细胞VEGF蛋白表达的影响
Western blotting法检测结果显示，100 nmol/L的VEGF siRNA 转染后，细胞VEGF基因表达与正常对照组比较显著下调（图2）。而脂质体组和错义序列组与正常对照组比较，VEGF基因表达则无明显变化。
2.3 MTT法检测树突细胞介导的CTL细胞的肿瘤杀伤效应
效靶比为50∶1时，CTL细胞的肿瘤杀伤效应最高，其中siRNAVEGF组的杀伤率为（66.3±6.8）%，sVEGF组为（17.3±1.8）%，两组比较差异有显著性（t=12.06，P<0.01）。
2.4 Hochest33258荧光染色观察CTL的肿瘤杀伤效应
在荧光显微镜下,经紫外线激发,正常对照组核染色质聚集、核碎裂、胞质浓缩。而实验组细胞核呈均匀的蓝色荧光。
2.5 IL12和IFNγ的分泌水平
siRNAVEGF组细胞培养上清液中IL12浓度为(393.2±72.5)ng/L,较sVEGF组(106.4±54.7)ng/L明显增高(t=7.74,P<0.01),但两组细胞都未发现IFNγ的自分泌。DC与正常人PBMC诱导的T细胞共培养72 h后，siRNAVEGF组上清液IFNγ含量为（126.4±41.9）ng/L，较sVEGF组的（43.3±12.5）ng/L明显增高（t′=4.66,P<0.05）。
3 讨 论
肿瘤发生的体内条件首先是机体抗肿瘤免疫功能受损。DC是体内功能最强的专职APC，能摄取、加工和呈递抗原[6]，是惟一能直接激活初始T细胞的APC，负责递呈肿瘤细胞抗原给T、B细胞而诱导抗肿瘤的体液免疫和细胞免疫应答，是抗肿瘤免疫的中心环节。发挥强大的免疫监视功能，特别是在肿瘤特异性T细胞免疫应答过程中起着非常重要的作用，在机体抗肿瘤免疫中发挥主导作用[8]。因此，DC数量减少或功能缺陷可直接导致机体抗肿瘤免疫功能低下[9,10]。肿瘤发生的另一体内条件是肿瘤的自分泌和旁分泌的交互作用，有报道肿瘤细胞分泌的细胞因子在肿瘤的免疫逃逸中发挥重要作用，其机制可能为荷瘤宿主体内的DC因肿瘤源性的细胞因子负调控受损所致。
VEGF是正常和异常血管生成的重要因子，在各种实体瘤中均有很强的表达[11]，对实体瘤的发生与发展起着关键作用[12]。 VEGF作为肿瘤细胞能够分泌的众多因子中最为重要的一种，可促进实体瘤血管生成，那么它是否在肿瘤免疫负调控中也起着关键的作用呢？
本实验应用MCF7乳癌细胞分泌的上清液培养正常人PBMC，诱导DC分化、成熟。同时依据iRNA原理，选取课题组已报道的最佳干扰浓度[13]，沉默MCF7乳癌细胞的VEGF基因，然后应用沉默VEGF基因后的MCF7乳癌细胞分泌的上清液培养正常人PBMC，观察所诱导的DC功能的改变。Western blotting检测结果显示，选用的化学合成法获得特异性靶向siRNA能够有效地沉默MCF7细胞的VEGF基因，VEGF基因沉默前后MCF7乳癌细胞分泌的上清液共培养的DC功能差别具有显著性。VEGF基因沉默前MCF7培养的上清诱生的DC不能有效地刺激、诱导正常T细胞的杀伤功能，而VEGF基因沉默后，由DC提呈抗原，诱导的CTL功能较沉默前明显增强。培养上清液中IL12浓度和协同刺激PMNC分泌IFNγ的含量也明显提高。
DC参与抗肿瘤的主要机制是保证DC对肿瘤抗原的摄取,摄取抗原后DC发育成熟，膜表面高表达MHCⅠ、Ⅱ类分子、共刺激分子等黏附分子。通过肽MHC类分子TCR、B7CD28等分子间的稳固连接，向T细胞内传递信号，促进T细胞的激活。二者缺乏时单一激发T细胞受体不能有效地刺激T细胞的增殖，甚至导致T细胞无能[14,15]。DC与T细胞结合后可分泌大量的IL12，诱导T细胞、自然杀伤细胞、淋巴因子激活杀伤细胞产生大量TNFγ、穿孔素和颗粒酶,增强对靶细胞的溶解作用[16]。实验结果说明，MCF7细胞分泌的VEGF抑制了DC的正常发育成熟，导致向T细胞内传递信号的分子间稳固连接不能形成，从而不能有效地刺激T细胞的增殖，对靶细胞不能发挥有效的杀伤作用。这可能是高表达VEGF实体瘤荷瘤宿主机体抗肿瘤免疫功能受损的机制之一。
本研究结果显示，VEGF作为一种关键的促血管生成因子，不仅参与肿瘤血管新生，而且还能显著影响宿主免疫系统中DC的免疫功能。这可能是瘤细胞在肿瘤微环境中逃避T细胞的攻击，造成肿瘤免疫抑制的机制之一。同时我们的研究结果还表明，甲基化修饰的siRNA能够在体外有效降解内源性基因VEGF的表达,抑制肿瘤源性的细胞因子的负调控，提高正常的抗肿瘤免疫功能。因此，安全有效的靶向siRNA干扰实体瘤VEGF的表达，将为肿瘤的治疗提供一条新的有效途径。
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