癫疒间发作过程中细胞凋亡与一氧化氮合酶、核因子-B的关系
发表时间：2010-08-24 浏览次数：433次
作者：刘月影,邓星强，李瑞，袁宝强 作者单位：1.徐州市儿童医院神经内科,江苏徐州;2.徐州医学院附属医院儿科，江苏徐州
【摘要】 目的 探讨癫疒间发作过程中细胞凋亡与一氧化氮合酶(NOS)、核因子- B(NF- B)的关系。方法 采用戊四氮(PTZ )致疒间大鼠模型，检测癫疒间发作后神经细胞凋亡、NOS和NF- B的变化。结果 细胞凋亡率在癫疒间发作后6 h开始升高，至24 h达到高峰，48 h下降，与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。NOS在癫疒间发作后1 h、24 h有2个分泌高峰，与对照组比较差异有显著性(P<0.05);对照组大鼠海马没有NF- B核转位细胞，而致疒间后NF- B核转位细胞显著上调，24 h达高峰(P<0.01)。结论 PTZ致疒间大鼠模型中NOS早期可能参与癫疒间发生，后期可能通过诱导NF- B产生而参与了神经细胞的凋亡。
【关键词】 癫疒间;细胞凋亡;一氧化氮合酶;NF- B
Relationship of nitric oxide synthase, NF-κB and cell apoptosis in epilepsy
LIU Yueying1*, DENG Xingqiang1, LI Rui1, YUAN Baoqiang2
(1. Department of Neurology, Xuzhou Children′s Hospital, Xuzhou, Jiangsu 221005, China;
2. Department of Pediatrics, The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College; Xuzhou, Jiangsu 221002)
Abstract:Objective To investigate the relationship of nitric oxide synthase (NOS), nuclear factor-κB (NF-κB) and cell apoptosis in epilepsy.Methods Animal model of epilepsy was established by pentylenetetrazol (PTZ) induction in rats. Following epilepsy seizure, the variations of apoptosis levels of the nerve cells at the different times, NOS and the activity of NF-κB in the rat hippocampus were determined by flow cytometry (FCM), chromatometry and immunohistochemistry, respectively.Results The apoptosis rate increased 6 h after seizure, reached its peak at 24 h and decreased at 48 h. The statistical differences were considered significant compared with the control group (P<0.05). The levels of NOS had two respective secretion peaks 1 h and the 24 h after epilepsy, and had the significant differences compared with the control group (P<0.05). In the control group, there were no cells with nuclear translocation of NF-κB in the rat hippocampus, while the expression of cells with nuclear translocation of NF-κB in the PTZ group was remarkably upregulated and reached its peak 24 h after seizure (P<0.01).Conclusion In the PTZ group, NOS may participate in the seizure generation in the early stage, while in the latter stage it may be involved in cell apoptosis by inducing the activation of NF-κB.
Key words: epileosy; cell apoptosis; nitric oxide synthase; NF-κB
本实验室最近证明一氧化氮(nitric oxide, NO)可诱导癫疒间发作后细胞凋亡的发生[1],然而NO诱导癫疒间发作后细胞凋亡机制仍不清楚。核因子-κB (nuclear factor κB, NF-κB)作为一种重要的信号传导因子,可通过其p65/p50异源二聚体的活化形式进入细胞核与DNA上相应靶基因位点结合对细胞内外界刺激作出快速反应。最新研究表明,NO可通过NF- B启动小鼠巨噬细胞凋亡的发生[2]。NO是由一氧化氮合酶催化L一精氨酸产生的。因此,本研究选择NF-κB p65和NOS作为研究NO诱导癫疒间凋亡信号传导机制的突破点,探讨NF- B信号转导途径是否参与NO诱导的癫疒间发作后细胞凋亡。
1 材料和方法
1.1 材料 雄性SD大鼠64只,鼠龄2.5个月左右,体重200～250 g,徐州医学院实验动物中心提供。随机分为对照组，致疒间30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h组。主要试剂：PTZ、碘化丙啶(PI， Sigma公司), NOS试剂盒(南京建成生物制品有限公司),免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司 )。
1.2 癫疒间模型制备 大鼠腹腔内注射PTZ(60 mg/kg)。参照Racine 6级(0～Ⅴ级)评定发作标准[3]：0级：无任何发作迹象;Ⅰ级:凝视、咀嚼和须动;Ⅱ级:点头或湿狗样抖动、搔抓;Ⅲ级:前肢局限性阵挛;Ⅳ级:伴后肢站立的全身强直性发作;Ⅴ级:伴站立并摔倒的全身强直-阵挛性发作。选择出现Ⅴ级发作者作为癫疒间模型。对照组用等容生理盐水代替PTZ注射。
1.3 方法
1.3.1 标本制备 取每只大鼠脑组织，冰上取出海马，制成10%匀浆液,取上清-20℃冰箱保存待测NOS。沉淀反复洗涤、过滤后制成海马单细胞悬液，调整细胞数在1×109/L，用预冷的70%乙醇固定,4℃过夜。
1.3.2 NOS的检测 按试剂盒说明书进行。
1.3.3 流式细胞仪检测 取单细胞悬液1 ml离心, PBS漂洗2次,加PI染色液1.0 ml(PI 50 mg/L、RNA酶A 200 mg/L),4℃染色30 min即上机分析，得出细胞凋亡百分比。
1.3.4 免疫组化染色 按试剂盒说明书进行，一抗NF- B p65浓度为1∶50,以胞核出现棕黄色颗粒为染色阳性。每张切片分别在海马CA1区随机观察3个不连续的视野(×400),取其平均值,作为该只动物的NF- B p65阳性表达数。
1.4 统计学处理 数据以±s表示,采用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析。P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 NOS检测结果 癫疒间发作后大鼠海马NOS迅速升高，1 h达第1个分泌高峰，之后下降，在6～12 h再次升高，24 h达第2个高峰，之后下降。见表1。
2.2 细胞凋亡检测结果 癫疒间发作后12 h细胞凋亡开始升高，24 h达到高峰，与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。见表1。
2.3 NF- B p65检测结果 对照组未见NF- B p65核转位阳性细胞，胞浆内少量NF- B p65蛋白表达,着色浅淡(图1A)。致疒间后6 h核转位阳性细胞数较正常组增加;24 h增加达高峰(图1B)(P<0.01)。具体数据见表1。表1 PTZ致疒间大鼠海马NOS、NF-κB p65和细胞凋亡率的变化 与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01
3 讨 论
近年来人们对癫疒间的发病机制进行了大量的研究，大量的实验表明细胞凋亡在癫疒间所致的脑损伤过程中发挥重要的作用。但目前癫疒间发作所致的细胞凋亡的分子机制尚不十分明确。NO作为一种新型神经递质，在中枢神经系统中发挥复杂而重要的作用[4]。本实验所测定的为总的NOS,其可以催化底物L-精氨酸生成NO。而NF-κB是一类与转录活性有关的蛋白质家族。其中起主要作用的是p65/p50异源二聚体，在胞质中p65/p50因与抑制蛋白IκB (inhibitory protein kappa B)结合而失活。当细胞受到内外刺激时IκB被上游激酶所降解，NF-κB被激活并转入核内，与特定的DNA序列结合发挥对靶基因调节而起到相应作用。有研究显示NO可以通过激活一些相关的蛋白如NF-κB等而诱导凋亡[5]。那么在癫疒间发作过程中三者之间的关系如何?
本实验表明,PTZ能使NOS迅速升高，至1 h NOS达第1个分泌高峰，而未检测到NF-κB和细胞凋亡，NOS在6 h后再次升高，随着NOS的升高，NF-κB和细胞凋亡开始出现，至24 h三者同时达到高峰，随之三者开始下降,提示癫疒间发作后细胞凋亡与NO和NF-κB密切相关。可能的机制是：PTZ作为一种兴奋性氨基酸激活N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)，使细胞内钙增加，进一步激活了依赖钙-钙调蛋白的组成型NOS，使分泌达第1个高峰;而NO可抑制NMDAR，下调钙内流，使二者出现下降趋势，可能参与了癫疒间的发生和早期脑保护;但随着惊厥时间的延长，NOS再次升高，与细胞凋亡和NF-κB有明显的时间相关性，提示后期产生的NOS可能是不依赖钙的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，从而产生了过多的NO，通过诱导NF- B的产生而造成了神经元凋亡。但也有研究显示NF-κB也存在2个分泌高峰，1个在0.5～1 h，1个在24～48 h[6]。而我们只检测到1个高峰,可能与检测方法和模型有关。
本实验同时检测了癫疒间发作过程中细胞凋亡、NOS和NF-κB p65的表达，发现在癫疒间发作过程中三者密切相关，提示NO早期轻度表达可能与癫疒间发生和早期脑保护有关，而后期的过度表达可能通过诱导NF-κB p65表达导致细胞凋亡的发生。
【参考文献】
[1] 刘月影,邓星强,徐庄剑,等.癫疒间发作过程中一氧化氮合酶与细胞凋亡的关系[J].实用儿科临床杂志,2007,22(23):1817-1818.
[2] 邓仲良,吴移谋,曾焱华,等.解脲脲原体脂质相关膜蛋白通过激活核因子κB调控诱导性一氧化氮合酶在小鼠巨噬细胞中的表达[J].微生物学报,2006,46(5):807-811.
[3] White HS. Animal models of epileptogenesis [J]. Neurology, 2002, 59(9 suppl 5):S7-S14.
[4] 厉青,张正春.一氧化氮在脑损伤中的作用[J].中国误诊学杂志，2007，7(4)：691-693.
[5] Cooper RG, Magwere T. Nitric oxide-mediated pathogenesis during nicotine and alcohol consumption [J]. Indian J Physiol Pharmacol,2008,52(1):11-18.
[6] Domanska-Janik K, Bronisz-Kowalczyk A, Zajac H, et al. Interrelations between nuclear-factor kappa B activation, glial response and neuronal apoptosis in gerbil hippocampus after ischemia [J]. Acta Neurobiol Exp (Wars), 2001, 61(1): 45-51.
