急性心肌梗死患者应用粒巨噬细胞集落刺激因子后血CD34+细胞和炎性因子的变化

作者:邓争荣,马爱群,杨春

    作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院心内科，环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安 710061；         【摘要】  目的 观察急性心肌梗死患者应用粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)后，外周血CD34+细胞的变化，探讨GMCSF对炎性因子的影响。方法 20例急性心肌梗死患者被随机分为GMCSF[10μg/(kg·d)，共7d]组和对照组(生理盐水)。应用流式细胞仪检测患者外周血CD34+细胞的绝对计数。应用酶联免疫法及放射免疫法检测两组患者及10例健康者血C反应蛋白(CRP)、白细胞介素6(IL6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的水平。结果 与对照组相比，GMCSF组在应用GMCSF后外周血CD34+细胞数明显增高，于第7天达到高峰(P<0.05)；心肌梗死患者血CRP、IL6及TNFα水平均明显高于健康者(P<0.05)；GMCSF组与对照组相比，CRP水平从第3天时开始升高，第10天时较对照组有明显的差别(P<0.05)；两心梗组在IL6及TNFα水平上均无统计学意义的差别。结论 GMCSF可有效的动员急性心肌梗死患者外周血CD34+细胞，亦可增加CRP的水平。

   【关键词】  急性心肌梗死；GMCSF；CD34+细胞；CRP

    目前，应用干细胞移植治疗急性心肌梗死已成为治疗缺血性心脏病的一大热点，此种细胞移植治疗可改善心脏功能，减少梗塞面积，改善心室重构[1]。利用干细胞动员剂治疗急性心肌梗死亦被发现有同样好的疗效[2]，且它具有无创及应用简便等优点。国内外多应用粒细胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor, GCSF)动员治疗急性心肌梗死。本研究应用另一种干细胞动员剂：粒巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony stimulating factor, GMCSF)，观察其对急性心肌梗死患者外周血CD34+细胞的动员效果，及其对体内炎性因子的影响，从而为应用干细胞动员剂治疗急性心肌梗死提供一定的临床依据。

　　1  对象与方法

　　1.1  对象

　　本研究选择了20例发病在12h内的急性心肌梗死患者。所有患者均满足以下标准：胸痛持续30min，舌下含服硝酸酯类不缓解；心电图异常Q波；心肌酶谱升高。患者排除标准如下：①严重持续的心力衰竭(心功能>Killip II级或射血分值<25%)；②肿瘤；③糖尿病视网膜病变；④类风湿性关节炎；⑤任何严重致命性疾病；⑥对药物过敏。另外，本研究还选择了10例经冠状动脉造影证实无冠心病的健康者。本研究通过了西安交通大学医学院第一附属医院伦理委员会的批准，患者经详细了解研究过程及所承担的风险后，均签署了同意参加本研究的知情同意书。

　　1.2  用药方法

　　本研究是一个随机、盲法、安慰剂对照性研究。符合入选标准的患者，在签署知情同意书后，随机进入GMCSF组和对照组。在常规治疗急性心肌梗死的基础上，GMCSF组患者腹部脐周皮下注射GMCSF (由华北制药公司惠赠)，剂量10μg/(kg·d)，共7d；对照组患者在相同部位注射相同剂量的生理盐水，共7d。治疗期间，由研究者每天记录药物相关的不良反应。

　　1.3  动员效果的测定

　　采集GMCSF组患者用药第1、3、7、10、14天，对照组患者第1、7、14天外周静脉血2mL，放入EDTA抗凝的试剂管中，充分混匀，置于室温条件下。在采集后24h内必须进行外周血CD34+细胞的检测。外周血CD34+细胞检测试剂盒由BectonDickinson公司提供。按照试剂盒说明书进行操作。检测所使用的流式细胞仪由西安交通大学医学院第二附属医院血液内科提供，仪器由BectonDickinson公司生产，型号：FACSCaliburTM。外周血CD34+细胞用每微升的细胞数来表示。

　　1.4  炎性因子的测定

　　早晨7时采集10名健康者及所有心梗患者入院后第1、3、7、10和14天时的外周静脉血2mL。采用酶联免疫法检测血浆高敏C反应蛋白水平(Creactive protein, CRP)，采用放射免疫分析法检测血中白细胞介素6(interleukin6, IL6)和肿瘤坏死因子α(necrotic factorα, TNFα)的水平。高敏C反应蛋白检测试剂盒由晶美生物制品有限公司提供，白细胞介素6和肿瘤坏死因子α检测试剂盒由北京东亚免疫技术研究所提供。均按试剂盒说明书进行操作。

　　1.5  统计学处理

　　所有资料均采用SPSS11.5统计软件进行处理。计量资料用均数±标准差表示。任何两个均数间的比较用Studentt检验，多个均数的比较应用ANOVA分析，计数资料的比较用χ2检验。检测水平为双侧，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结  果

　　2.1  患者临床特征

　　GMCSF组和对照组在年龄、性别及心血管危险因素上均无统计学意义上的差别，在 CKMB高峰值和肌钙蛋白I水平亦无明显差别。两组在入院后接受药物治疗方面无统计学上的差别(表1)。表1  GMCSF组和对照组患者的临床基本特征（略）

　　2.2  不良反应

　　使用GMCSF后可能出现的不良反应包括：发热、出汗、肌肉酸痛、流感样症状(打喷嚏、鼻塞等)、注射部位的皮疹以及骨痛。治疗期间GMCSF组中有5名患者出现发热，平均38.5℃。对照组中有1名患者出现低热。因为发热，1名GMCSF组患者在治疗5d后拒绝继续进行治疗。GMCSF组有1名患者出现明显的流感样症状，另1名患者感到骨痛。这些不良反应均在用药结束后自行消失。我们也观察了心肌梗死患者使用GMCSF的安全性。GMCSF组患者在治疗期间无死亡、无再发心肌梗死、心绞痛恶化、恶性心律失常和心力衰竭等不良心血管事件的发生。

　　2.3  动员效果

　　心肌梗死患者在应用GMCSF后，外周血CD34+细胞逐渐升高，在用药第7天达到高峰，停药后细胞水平逐渐降低，于第14天降至与第1天相同的水平。对照组患者外周血CD34+细胞水平在第1、7、14天基本相近。两组第1天CD34+ 细胞数无明显差异，但GMCSF组第7天的细胞数水平明显高于对照组(P<0.05，图1)。

　　2.4  炎性因子的检测结果

　　心肌梗死患者血CRP明显高于健康者(P<0.05)，GMCSF组与对照组相比，CRP水平从第3天时开始升高，第10天时较对照组有明显的增加(P<0.05，图2)。两心肌梗死组血IL6及TNFα水平均明显高于健康者(P<0.05)，但GMCSF组与对照组比较无明显差异。

　3  讨  论

　　GMCSF和GCSF是血液科及肿瘤科常用的造血干细胞动员剂，已被广泛应用于临床。作为单用动员剂来讲，许多研究认为GCSF可比GMCSF动员出更多的CD34+细胞[3]，但也有研究发现，GMCSF比GCSF可动员出更为原始的CD34+、CD38-的骨髓干细胞[4]。在利用干细胞动员的方法治疗急性心肌梗死的研究中，Ince等[2]发现GCSF可使急性心肌梗死患者外周血CD34+ 的单个核细胞增加20倍。本研究发现应用GMCSF后，外周血CD34+细胞可明显增加，但平均只达到5倍，低于GCSF的动员效果。其原因一方面可能与GMCSF本身动员CD34+细胞的效果低于GCSF有关，另一方面，国产的GMCSF的动员效果可能与国外的药物效果之间亦存在一定的差距。急性心肌梗死会引发一系列的炎性反应及细胞因子的活化。大量的研究发现，心肌梗死后心肌的缺血损伤会促使炎性因子IL6、TNF α及CRP明显升高。本研究发现两心肌梗死组这三个炎性因子水平明显高于健康者，与既往研究结果类似。与此同时，本研究发现心肌梗死患者应用GMCSF后，血CRP逐渐增加，但IL6及TNFα的水平较对照组无明显变化。CRP是肝脏合成的一种急性期反应蛋白，它的增加可反映体内炎症的活动程度。Suleiman等[5]研究发现，急性心肌梗死患者CRP高水平组较低水平组远期发生心力衰竭和死亡的危险大大增加，它可作为预测心肌梗死患者将来发生心衰和死亡的预测因子。Brunetti 等[6]发现心肌梗死患者高水平的CRP与6个月随访中发生不良心血管事件相关。由此可见心肌梗死后血中CRP的升高对于心肌梗死患者的预后是非常不利的。Seiler 等[7]在用GMCSF治疗冠心病患者时，发现治疗前后血浆CRP明显增加。Wang 等[8]在应用GCSF治疗慢性缺血性心脏病患者时，亦发现GCSF可显著增加第7天和第14天的CRP水平。可见，GMCSF和GCSF在显著动员心肌梗死患者造血干细胞的同时，可能会增加CRP的水平。心肌的急性缺血损伤本身即可动员机体的干细胞。Satoshi 等[9]研究发现，急性心肌梗死后，体内的CD34+的单个核细胞及内皮前体细胞显著增加，于心肌梗死后第7天最为明显。Wojakowski 等[10]研究发现急性心肌梗死不仅可动员体内CD34+、cmet+的干细胞进入外周血，而且这些干细胞还可表达心肌和内皮细胞的标志物。由此可见，应用干细胞动员剂治疗急性心肌梗死可能是体内对于缺血损伤生理反应的一种复制和放大，似乎更符合生理过程。而且，它具有无创、应用简便和费用相对低廉等优点。因此，应用干细胞动员剂治疗心肌缺血损伤已越来越得到许多研究者的重视，并且已取得了较佳的临床效果[2]。GCSF/GMCSF除了动员干细胞的作用外，还具有其他的一些生物学作用。Koji 等[11]发现GCSF可使猪心肌梗死后内皮细胞的凋亡减少，血管生成增加。Buschmann 等[12]研究发现GMCS F可延长单核/巨噬细胞的生存周期，从而促进血管的生成。实际上，GMCSF也可动员出许多单个核细胞，并且促使其分化为巨噬细胞。在损伤修复和瘢痕愈合过程中，巨噬细胞是大量细胞因子和生长因子的重要来源。因此，本研究仅发现GMCSF影响CRP的水平，现还不清楚GM/GCSF是否会影响其他抗炎和促炎因子的变化，但这些因子的改变必将会对心肌梗死患者造成有利或不利的生物学作用。本研究发现心梗患者使用GMCSF的过程中，最常发生的不良反应为发热，未发现GMCSF组出现不良的心血管事件，如恶性心律失常、心绞痛恶化及再发心肌梗死等。可见，急性心肌梗死患者应用GMCSF是相对安全的。本研究在证实GMCSF可显著动员急性心肌梗死患者外周血CD34+细胞的同时，发现其亦会增加血CRP的水平。本研究的发现对应用干细胞动员剂治疗缺血性心脏病提供了新的启示。

【参考文献】  [1]Wollert KC, Meyer GP, Lotz J, et al. Intracoronary autologous bonemarrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial [J]. Lancet, 2004, 3649(9429):141148.

　　[2]Ince H, Petzsch M, Kleine HD, et al. Prevention of left ventricular remodeling with granulocyte colonystimulating factor after acute myocardial infarction: final 1year results of the frontintegrated revascularization and stem cell liberation in evolving acute myocardial infarction by granulocyte colonystimulating factor (FIRSTLINEAMI) trial [J]. Circulation, 2005,112(9 Suppl):173180.

　　[3]Lane TA, Law P, Maruyama M, et al. Harvesting and enrichment of HPC mobilized into the peripheral blood of normal donors by GMCSF or GCSF: Potential role in allogeneic transplantation [J]. Blood, 1995, 85(1):275282.

　　[4]Armitage JO. Emerging applications of recombinant human granulocytemacrophage colony stimulating factor [J]. Blood, 1998, 92(12):44914508.

　　[5]Suleiman M, Khatib R, Agmon Y, et al. Early inflammation and risk of longterm development of heart failure and mortality in survivors of acute myocardial infarction predictive role of Creactive protein [J]. J Am Coll Cardiol, 2006, 47(5):962968.

　　[6]Brunetti ND, Troccoli R, Correale M, et al. Creactive protein in patients with acute coronary syndrome: Correlation with diagnosis, myocardial damage, ejection fraction and angiographic findings [J]. Int J Cardiol, 2006,109(2):248256.

　　[7]Seiler C, Tilmann P, Kerstin W, et al. Promotion of collateral growth by granulocytemacrophage colonystimulating factor in patients with coronary artery disease A randomized, doubleblind, placebocontrolled study [J]. Circulation, 2001,104(17):20122017.

　　[8]Wang YZH, Kristina T, Rasmus SR, et al. Effect of mobilization of bone marrow stem cells by granulocyte colony stimulating factor on clinical symptoms, left ventricular perfusion and function in patients with severe chronic ischemic heart disease [J]. Int J Cardiol, 2005, 100(3):477 483.

　[9]Satoshi S, Toyoaki M, Hisao I, et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction [J]. Circulation, 2001,103(12):27762779.

　　[10]Wojakowski W, Tendera M, Michalowska A, et al. Mobilization of CD34/CXCR4+, CD34/CD117+, cmet+ stem cells, and mononuclear cells expressing early cardiac, muscle, and endothelial markers into peripheral blood in patients with acute myocardial infarction [J]. Circulation, 2004,110(20):32133220.

　　[11]Koji I, Hiroyuki T, Masashi O, et al. Effects of GCSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 325(4):13531359.

　　[12]Buschmann IR, Hoefer IE, Royen NV, et al. GMCSF: a strong arteriogenic factor acting by amplification of monocyte function [J]. Atherosclerosis, 2001,159(2):343356.