先天性心脏病合并肺动脉高压一氧化氮合酶mRNA表达及临床意

作者:封加涛,苏艳玲,龚光甫

     【关键词】  心脏缺损,先天性；高血压,肺性；一氧化氮合酶；RNA,信使

　　FENG JiaTao1,  SU YanLing1, GONG GuangFu2,  HU DongXu2,  CAOYa2

    1Department of Cardiovascular Surgery, First Peoples Hospital of Foshan  City, Foshan  528000, China, 2Department of Cardiovascular Surgery, Xiangya Hospital, Zhongnan University, Changsha  410011, China

    【Abstract】 AIM:  To explore  the  pathophysiological  significance of  nitric oxide(NO) and nitric oxide synthase(NOS) in congenital heart defects with pulmonary hypertension. METHODS:  Twentyfour patients with congenital heart defects  were  divided  into  3 groups:  mild pulmonary hypertension group(n=8), moderate or severe pulmonary hypertension group(n=9), and nonpulmonary hypertension group(n=7). NOS mRNA expression was detected in  lung  tissues  with  reverse  transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR). RESULTS: The NOS mRNA expression levels in the  patients  with  moderate  or severe pulmonary hypertension were much lower than those  in  the ones with mildpulmonary hypertension  or nonpulmonary hypertension (P<0.05). There was an inverse correlation between  the  NOS mRNA  expression level and the pulmonary  arteriopathy  in  the  patients  with  pulmonary hypertension (r=-0.833, P<0.01). CONCLUSION:  In patients with  congenital  heart defects associated with pulmonary hypertension, NO  and  NOS   play  a  role  in pathological process of pulmonary  arteriopathy,  and the NOS mRNA expression level was  proportional to the severity of pulmonary hypertension or pulmonary  arteriopathy.

    【Keywords】  heart defects, congenital;    hypertension, pulmonary;  nitric oxide synthase; RNA, messenger

    【摘要】 目的： 了解一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）在先天性心脏病合并肺动脉高压中的病理生理作用. 方法： 将24例左向右分流先天性心脏病患者分为三组：轻度肺动脉高压8例，中重度肺动脉高压9例和无肺动脉高压7例,应用逆转录多聚酶链式反应（RTPCR）检测患者肺组织中NOS mRNA的表达. 结果:  NOS mRNA表达水平在中重度肺高压组较轻度肺高压组和无肺高压组显著减低（P<0.05）；NOS mRNA表达与肺高压肺血管病变程度呈负相关（r=-0.833, P<0.01）. 结论: NOS, NO 参与先天性心脏病合并肺动脉高压肺血管病变的病理过程;肺组织NOS mRNA的表达， 随肺动脉高压和肺血管病变程度的加重而下降.

    【关键词】  心脏缺损，先天性；高血压，肺性；一氧化氮合酶；RNA，信使

      左向右分流先天性心脏病，常合并肺动脉高压，其病理特征为渐进性肺血管病变，病变严重程度影响患者的预后， 然而这些肺血管病变发生的机制尚未完全明了. 研究表明，先天性心脏病引起的肺动脉高压,于病变早期即有肺血管内皮细胞超微结构的改变，而血管内皮细胞在合成、释放多种生物活性物质以调节血管张力，抑制平滑肌细胞增生，维持肺循环的低张、低压状态［1］，在延缓肺血管病变的进展方面有重要意义. 其中， 具有多种生理功能的细胞内信息分子一氧化氮（nitric oxide，NO）尤为重要［2］.  NO极不稳定,随着一氧化氮合成的限速酶一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）基因的克隆成功［2］.  为从分子生物学水平研究NO的病理生理作用提供了重要手段. 为此，我们采用现代分子生物学技术，观察先天性心脏病合并肺动脉高压患者肺组织标本中NOS mRNA 表达情况及其与肺动脉高压严重程度的关系，为阐明NO在先天性心脏病肺动脉高压病理生理中的作用提供理论依据.

    1对象和方法

    1.1对象胸心外科住院病例24(男14,女10). 年龄2~17岁. 经病史、体查、一般化验、胸部正侧位X线片、心电图、彩超等检查. 全部为先天性心脏病，17例并肺动脉高压,其中室间隔缺损19例，室间隔缺损＋主动脉窦瘤破裂1例，室间隔缺损＋房间隔缺损1例，室间隔缺损＋动脉导管未闭1例，房间隔缺损2例. 全部患者都在体外循环下进行手术. 术中在体外循环建立前测量肺动脉压力(PAP)，根据测压将24例病例分为无肺高压组、轻度肺高压组、中重度肺高压组三组，其中７例平均肺动脉压(MPAP)为(17.3±2.4) mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)确定为无肺高压组. 17例平均肺动脉压均超过， 超过国内目前使用的肺动脉高压的诊断标准值（肺动脉平均压大于20 mmHg），并结合临床资料有肺动脉高压表现（如临床听诊P2亢进， 胸片示肺动脉段突出，心电图示双室或右室肥大），认定术前合并肺动脉高压；其中，9例术中测压MPAP为(53.2±9.7) mmHg，肺动脉收缩压(SPAP)与体循环动脉收缩压(SAP)之比为0.76±0.10，确定为中重度肺动脉高压组［4］；8例术中测压MPAP为(24.4±3.3) mmHg, SPAP/SAP为0.36±0.15，确定为轻度肺动脉高压组［4］. 所有受试者均无糖尿病、心肌梗死、肾功能不全和原发性肺动脉高压等病史，未曾使用硝脂类等特殊药物. 三组间年龄、性别、血红蛋白(Hb)、血氧饱和度(SaO2)，均无显著性差别.

    Taq DNA聚合酶和dNTPs购自美国生命技术公司，AMV Reverse Transcription Kit,Pgem7ZF(+)/HaeIII购自Promega公司. NOSmRNA, β2MG mRNA引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成. NOS mRNA的引物序列［3］（5′引物：GGTGAATCCATACCAGCCTGATCCATGGAACAC, 3′引物：TACTCGAAACGCCTGTCCTTCTTCTTCGAATGG）.     β2MG mRNA引物序列(5′引物：CTCCAAAGATTCAGGTTTAC，   3′引物：ATCTTCAAACCTCCATGATG).

   1.2方法

    1.2.1组织标本的获取和保存于右肺上叶取一肺组织块约3 cm×2 cm×1 cm大小. 采取的组织块放入经处理后的冻存管内(分装)，立即置液氮中速冻，然后置于-70℃保存，以备提取组织总RNA和冰冻切片用.

    1.2.2肺组织血管的病理学分级肺组织切片，固定，HE染色，然后进行显微镜观察.

    1.2.3NOS mRNA的RTPCR半定量检测用Trizol试剂盒抽提RNA，A值在1.8~2.0之间, 1 μg RNA经反转录后取1/8体积5 μL反应液进行PCR, 条件为94℃  1 min，55℃引物退火2 min，72℃延伸3 min，共进行35个周期. 首次循环前先在94℃变性2 min，最后一次循环后在72℃延伸10 min. NOS和β2MG 在同一管内扩增，取10 μL PCR产物在2 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳、照相. 以图像分析系统对电泳结果照片上NOS,β2MG特异性扩增产物的电泳带密度扫描定量，然后计算出NOS和β2MG密度之比值，确定NOS mRNA的相对表达水平.

    统计学处理： 用SPSS6.0统计软件包作统计处理，实验数据用x±s表示. 先进行三组间方差齐性检验，在方差齐的基础上作方差分析，若有显著差异，则进一步做三组间两两比较的q检验；对NOS mRNA表达与病理分级进行相关分析,如方差不齐采用秩和检验,P<0.05为有统计学差异.

    2结果

    2.1肺组织血管的病理学分级17例肺高压患者肺组织血管病理改变程度参照 Healthy等［3］的病理分级标准，其中血管形态正常5例，1级改变6例，2级改变4例，3级改变2例. 组织学变化在肌型动脉和细动脉较弹力型动脉明显. 中重度肺高压病例的肺血管改变也明显比轻度肺高压病例的改变重.

    2.2RTPCR检测用RTPCR方法检测无肺高压组、轻度肺高压组、中重度肺高压组肺组织标本中NOS mRNA相对表达水平，电泳结果见图1.  中重度肺动脉高压组NOS mRNA表达水平较非肺高压组和轻度肺高压组NOS mRNA表达显著降低（P<0.05），轻度肺高压组与非肺高压组NOS mRNA表达水平无差别［(0.86±0.04) vs (0.92±0.03, P>0.05］.

    1,16: 标记物; 6~8: 轻度肺高压样本; 2~5: 无肺高压样本; 9~12: 中重度肺高压样本; 13: 内参照; 14: 样本; 15: 阴性对照物.

    图1RTPCR电泳结果

    2.3肺高压组肺组织NOS mRNA表达与肺血管病理分级的相关分析结果显示肺组织NOS mRNA表达水平与肺血管病理分级呈明显负相关（r=-0.833, P<0.01）.

    3讨论

    本研究采用RTPCR分子生物学技术，检测先天性心脏病无肺高压、轻度肺高压和中重度肺高压患者肺组织标本中NOS mRNA的表达，结果表明，NOS mRNA表达水平与肺动脉高压的严重程度密切相关， 即肺高压程度越重， 肺血管病变越重，NOS mRNA表达下降越明显. 中重度肺高压患者NOS mRNA表达较无肺高压和轻度肺高压患者明显减低(P<0.05)， 而在轻度肺高压患者中NOS mRNA表达下降不明显(P>0.05)，说明NOS mRNA表达下降是继发于肺血管内皮细胞受损之后，且可能参与肺动脉高压的发生、发展过程.

    无肺高压者，在肺血流量增多时，由于血管壁切变应力增加，可剌激肺血管内皮细胞分泌NO［4］， 以扩张肺血管适应血流动力学的变化，即机体处于一种代偿状态. 但切变应力、高动力循环本身，特别是涡流及涡流切变应力对血管内皮有损伤作用［5］ ， 不引起NOS mRNA表达增加，或不引起NO释放增加. 故随病程进展，一旦这种代偿机制受损，则表现为肺动脉高压状态，并随肺血管病变的严重程度而加重. 本研究表明，中重度肺高压NOS mRNA 表达水平显著降低，而轻度肺高压时NOS mRNA表达下降不明显. Nakamura等［6］发现，先天性心脏病于肺高压前期(有肺血增多，但无肺高压)，乙酰胆碱舒张血管的作用消失， 而保留硝普钠对血管的舒张作用， 即乙酰胆碱不能再增加NO的分泌，当出现肺血管病变时，对硝普钠和乙酰胆碱的舒张作用显著减弱，因此认为这种早期舒张功能受损是肺血管病变的一个重要特征.

    Villanueva等［7］通过检测新生儿持续肺高压患儿肺组织NOS mRNA,其表达下降. 本研究与此结果相符. 另有研究应用外源性NO吸入治疗急、慢性肺动脉高压，取得良好效果［8］， 也支持在肺高压时内源性NO合成减少或相对不足.

    先天性心脏病合并肺动脉高压NOS mRNA 表达减低的原因： ① 肺血流量增多，血管壁切变应力增加，特别是涡流损伤了血管内皮细胞的形态和功能，即内皮受损后继发引起NOS mRNA表达下降；② 内皮受损，合成分泌NO减少，失去对肺血管的舒张保护调节，血管收缩因子的作用增加，加重血管功能的损害，进一步减少NOS mRNA 表达.

    NOS mRNA表达减低或相对不足的后果： ① 由于NO 合成分泌减少，血管舒张功能受损,对内皮的保护作用亦受损,且受损的肺血管对缩血管物质特别敏感，如NO不仅可对抗内皮素的收缩血管作用，且抑制它的释放；NO减少，使NO对内皮素的抑制减少，从而导致肺小动脉收缩. ② NO能抑制细胞的有丝分裂，从而抑制血管平滑肌细胞的增生. 肺高压时表现为血浆内皮素增多，肺血管内皮素1 mRNA表达增加，而内皮素可促进平滑肌细胞的增生. 这一对重要的舒张和收缩因子失衡，使NO不能有效拮抗内皮素收缩血管和促进平滑肌细胞增生的效应［10］，结果血管收缩，血管腔变窄，外周阻力增大；而肺高压又进一步加重内皮细胞受损，形成恶性循环，使肺高压进一步加重，即NO在肺高压患者肺血管的构建中起重要作用. ③ NO减少，使NO抑制血小板及白细胞在肺内聚集和黏附的功能受损，血小板及白细胞更易黏附于损伤的内皮细胞上，形成血栓； 并激活血小板释放血栓素A2(TXA2)等收缩因子，血栓栓塞将导致肺小动脉闭塞或数目减少，肺血管阻力增加，更加重肺动脉高压［9］.

    本结果给我们以下启示: 先天性心脏病肺动脉高压一旦形成，是肺循环失代偿的表现，NO分泌不足，将加快肺动脉高压的进程，故宜早期手术. 可利用外源性NO 类药物治疗先天性心脏病合并肺动脉高压，特别是内源性NO药物的开发和应用，有可能延缓肺动脉高压的进程.

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    1佛山市第一人民医院心血管外科, 广东 佛山 528000,  2中南大学湘雅医院心血管外科，湖南 长沙